Medição da Capacidade de Importação de Proteínas das Mitocôndrias Musculares Esqueléticas

Mitocôndrias são organelas que existem em morfologias complexas em diferentes tipos celulares e são reconhecidas por possuir uma gama crescente de funções que são fundamentais para a saúde celular. Como tal, eles não podem mais ser reduzidos apenas a organelas produtoras de energia. Mitocôndrias são os principais reguladores metabólicos, determinantes do destino celular e centros de sinalização, das quais as funções podem servir como indicadores úteis da saúde celular geral. Nas células musculares esqueléticas, estudos de microscopia eletrônica revelam a presença de mitocôndrias subsarambimais geograficamente distintas (SS) e intermyofibrilar (FMI), que exibem um grau de conectividade1,2,3,4 que agora é reconhecida como altamente dinâmica e adaptável às mudanças nos níveis de atividade muscular esquelética, bem como com idade e doença. O conteúdo mitocondrial e a função muscular podem ser avaliados de inúmeras ^formas5,6, e métodos tradicionais de isolamento de organela têm sido aplicados para entender melhor as capacidades respiratórias e enzimáticas (Vmax) das mitocôndrias distintas da influência do meio ^celular7,8. Em particular, esses métodos tradicionais revelaram sutis distinções bioquímicas entre mitocôndrias isoladas das regiões subsarcolemmal e intermiofibrilar, desfaçando possíveis implicações funcionais para o metabolismo nessas regiões subcelulares8,9,10,11.

A biogênese das mitocôndrias é única em exigir a contribuição de produtos genéticos do DNA nuclear e mitocondrial. No entanto, a grande maioria deles são derivados do núcleo, uma vez que a transcrição do MTDNA só leva à síntese de 13 proteínas. Uma vez que as mitocôndrias normalmente compreendem >1000 proteínas envolvidas em diversas vias metabólicas, a biogênese da organela requer um meio bem regulado de importação e montagem de proteínas precursoras do citosol nos vários subcompartidores mitocondriais para manter a estequiometria e a função ^{adequadas12,13}. Proteínas codificadas por nuclear destinadas a mitocôndrias normalmente carregam uma sequência de alvo mitocondrial (MTS) que as visa à organela e facilita sua localização subcompartidária. A maioria das proteínas ligadas à matriz contém um MTS terminal N cleavável, enquanto aquelas destinadas à membrana mitocondrial externa ou interna geralmente têm domínios internos ^{de segmentação14}. O processo de importação é realizado por um conjunto de diversos canais que fornecem múltiplas vias para entrada na ^organela13. A translocase do complexo de membrana externa (TOM) transporta precursores do citosol para o espaço intermembrano, onde são reconhecidos pela translocase do complexo de membrana interna (TIM). Este complexo é responsável pela importação de precursores codificados nucleares para a matriz, onde os proteases cortam a preseqüência de alvo do terminal N. As proteínas destinadas à membrana externa podem ser diretamente inseridas nesta membrana através do complexo TOM, enquanto as destinadas à membrana interna são inseridas por uma proteína TIM, especificamente TIM22. Após sua importação, as proteínas são processadas por proteases residentes e acompanhantes e muitas vezes se combinam para formar complexos maiores, como os encontrados na cadeia de transporte de elétrons.

A importação de proteína mitocondrial também serve como uma medida da saúde mitocondrial, pois esse processo conta com a presença de potencial de membrana e uma fonte de energia na forma de ^ATP15. Por exemplo, quando o potencial da membrana é dissipado, a proteína quinase PINK1 não pode ser absorída pela organela, e isso leva a sinais de fosforilação que desencadeiam o início da degradação da organela através de uma via chamada ^{mitofagia16,17}. Em circunstâncias semelhantes, quando a importação é impedida, a proteína ATF5 não pode entrar na organela, e posteriormente se transloca para o núcleo, onde serve como fator de transcrição para a regulação da expressão genética ^UPR18,19. Assim, medir a eficiência de importação de proteínas pode fornecer uma visão abrangente da saúde da organela, enquanto a resposta à expressão genética pode ser usada para indicar o grau de sinalização retrógrada para o núcleo.

Apesar de sua óbvia importância para a biogênese das mitocôndrias e para a saúde celular em geral, a via de importação em mitocôndrias mamíferas é notavelmente subestudada. Neste relatório, descrevemos as etapas específicas envolvidas na medição da importação de proteínas precursoras em mitocôndrias musculares esqueléticas e fornecemos dados para ilustrar a resposta adaptativa do sistema de importação às alterações musculares e desuso, ilustrando a contribuição da importação de proteínas para a plasticidade adaptativa do músculo esquelético.