Aşı Geliştirme için Chlamydia muridarum'dan Rekombinant Majör Dış Membran Proteinine Hücresiz Ölçekli Üretim ve Adjuvan İlavesi

Tüm hayvan çalışmaları, Kaliforniya Üniversitesi, Irvine’de, Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından belirlenen yönergelere uygun olarak Halk Sağlığı Hizmeti (PHS) güvenceli tesislerde gerçekleştirildi. 1. Züccaciye hazırlama NOT: Hayvanlar için aşı sınıfı formülasyonların üretiminde kullanılan tüm malzemeler endotoksin içermez. Kirletici endotoksini yok etmek için, tamponları 180 ° C’de 4 saat boyunca bir fırında tutacak temizlenmiş cam eşyaları pişirin. 2. Tampon hazırlama Tablo 1’de listelenen 250 mL Ni afinite saflaştırma tamponu hazırlayın. 4 °C’de 6 aya kadar saklayın. 3. Reaksiyon hazırlığı 20 mg 1,2-dimyristoyl-sn-glisero-3-fosfokolin (DMPC) endotoksin içermeyen, 1.5 mL’lik bir santrifüj tüpüne tartın. 1 mL endotoksin içermeyen suda çözün, 1 dakika boyunca 6 A’da en az dört kez sonik hale getirin, aralarında 1 dakika duraklama olsun, berraklaşana kadar. 22 ° C’de 2 dakika boyunca 13.000 × g’da santrifüjleme yoluyla probdaki kirletici metalleri çıkarın ve ardından çözünmüş lipidi yeni bir 1.5 mL endotoksin içermeyen tüpe aktarın. 1 mg PEG5k-CA8 telodendrimer’i 1.5 mL endotoksin içermeyen bir tüpe tartın. Endotoksin içermeyen suda 20 mg/mL konsantrasyonda çözün. Tamamen eriyene kadar vorteks yapın ve 2 mg / mL’ye seyreltin. Yeni bir endotoksin içermeyen tüpte, 210 μL 20 mg / mL DMPC çözeltisini 210 μL 2 mg / mL telodendrimer çözeltisi ile birleştirin. 4. Alt birim aşı formülasyonları için MOMP-tNLP’lerin hücresiz üretimi Daha önce yayınlanmış bir protokolden değiştirilmiş hücresiz yöntemler kullanarak MOMP-tNLP’leri hazırlayın5.Hücresiz reaksiyonu kurmadan iki saat önce, prokaryotik hücresiz protein ekspresyon kitini açın ve sulandırma tamponlarından birini çözün. Çözüldükten sonra, bir tablet EDTA içermeyen proteaz inhibitör kokteyli ekleyin ve tamamen çözünmesine izin verin. 5 x 1 mL reaksiyonları çalıştırmak için tasarlanmış bir kit kullanarak bu protokolü izleyin.NOT: Tipik bir ölçek büyütme üretimi 3 x 1 mL’dir.Her 1 mL reaksiyon için, E. coli lizat şişesine 525 μL sulandırma tamponu ekleyin ve çözünmesi için hafifçe yuvarlayın. Reaksiyon katkı maddeleri (örneğin, ATP, GTP) içeren şişeye 250 μL sulandırma tamponu ekleyin ve çözünmesi için hafifçe yuvarlayın. Reaksiyon besleme şişesine 8.1 mL sulandırma tamponu ekleyin, lastik bir tıpa ile kapatın (kauçuk tıpanın iç kısmına dokunmamaya dikkat edin) ve çözünmesi için hafifçe ters çevirin/yuvarlayın. Amino asit karışım şişesine 3 mL sulandırma tamponu ekleyin, lastik bir tıpa ile kapatın ve çözünmesi için hafifçe ters çevirin / yuvarlayın.NOT: Kirlenmeye neden olabileceğinden lastik tıpanın iç kısmına dokunmamaya dikkat edin. Metiyonin şişesine 1.8 mL sulandırma tamponu ekleyin, çözünmesi için hafifçe yuvarlayın ve ardından kullanıma kadar buz üzerinde saklayın. Reaksiyon çözeltisini hazırlayın.E. coli lizat şişesine 225 μL sulandırılmış Reaksiyon Karışımı, 270 μL metiyonin içermeyen sulandırılmış amino asit karışımı ve 30 μL sulandırılmış metiyonin ekleyin. Ek olarak, 400 μL DMPC / telodendrimer karışımı, 15 μg MOMP plazmidi ve 0.6 μg Δ49ApoA1 plazmidi ekleyin. Karıştırmak için yuvarlayın/hafifçe sallayın.NOT: Her iki plazmitin de aynı plazmit omurgasından oluşturulduğundan emin olun. Girdap yapmayın. Toplam çözeltinin 20 μL’sini alın ve GFP eksprese eden kontrol reaksiyonu için 1.5 mL’lik bir tüpte bir kenara koyun (aşağıya bakınız). Besleme çözeltisini hazırlayın. Yem karışımı şişesine, metiyonin içermeyen 2.65 mL sulandırılmış amino asit karışımı ve 300 μL sulandırılmış metiyonin ekleyin. Çözünmesi için yuvarlayın/hafifçe sallayın.NOT: Şu anda, kullanılmayan sulandırma tamponu ve Metiyonin, saklama için dondurucuya geri gönderilebilir. 1 mL reaksiyon solüsyonunu hücresiz reaksiyon kitinde sağlanan iç reaksiyon odasına aktarın ve doldurulduğunda kapatın. Besleme çözeltisinin 10 mL’sini reaksiyon kabının dış haznesine aktarın ve kapatın.NOT: Hazneleri aşırı doldurmayın! Hem iç reaksiyon odasının hem de iç besleme odasının tepesinde hava kabarcıklarının varlığı reaksiyonu olumsuz yönde etkileyecektir. Kalan herhangi bir reaksiyon çözeltisi 1.5 mL’lik bir tüpe yerleştirilebilir ve ana kap ile birlikte karışmasına izin verilebilir. Daha önce alıntılanmış 20 μL reaksiyon karışımına 0.5 μL GFP kontrol plazmidi (0.5 mg/mL) ekleyin.NOT: Birçok kit, kalite kontrol amacıyla bir kontrol plazmidi ile birlikte verilir. Bir T7 promotörü ve E.coli ribozom bağlanma bölgesi (RBS) ile plazmidi eksprese eden çoğu GFP, kontrol plazmidi olarak da kullanılabilir. Reaksiyonu 300 rpm’de, 30 °C’de 18 saate kadar bir çalkalayıcıya yerleştirin. Reaksiyonun başarılı olduğunu doğrulamak için, 15 dakika kadar kısa bir inkübasyondan sonra kontrol GFP’sinin (Şekil 1A) sentezine bağlı floresan olup olmadığını kontrol etmek için bir UV ışık kaynağı kullanın.NOT: Bu koşulların, özellikle sıcaklığın, diğer zar proteinlerinin ekspresyonu için optimize edilmesi gerekebilir. 5. MOMP-tNLP saflaştırma Δ49ApoA1 proteini üzerindeki His-etiketini kullanarak MOMP-tNLP nanopartikül kompleksini hücresiz reaksiyon karışımından saflaştırmak için hareketsizleştirilmiş nikel afinite kromatografisi kullanın.1 mL His-Tag Saflaştırma Reçinesi bulamacını tek kullanımlık 10 mL’lik bir kromatografi kolonuna aktarın ve 3 mL Bağlayıcı tampon ile dengeleyin. Tamponun boşalmasına izin verin, çıkışı kapatın ve reçineye 250 μL Bağlayıcı tampon ekleyin. Hücresiz reaksiyonu kolona eklemeden önce, SDS-PAGE tarafından daha sonra analiz edilmek üzere 20 μL kaydedin. Hücresiz reaksiyonu dengelenmiş reçine ile karıştırın ve 1 saat boyunca 4 ° C’de bir laboratuvar külbütörü üzerinde inkübe edin. Kolonun kapağını açın, kapağı 500 μL ek Bağlama tamponu ile yıkayın ve bu sıvıyı kolonun geri kalanına ekleyin. SDS-PAGE tarafından daha sonra analiz edilmek üzere sıvı akışını kolondan toplayın. Kolonu 20 mM imidazol içeren 1 mL yıkama tamponu ile altı kez yıkayın ve fraksiyonları toplayın. Reçinenin yıkamalar arasında kurumasına izin vermeyin. İkinci yıkamada, 1 mL’lik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek reçineyi kuvvetlice çalkalayın. MOMP-tNLP’leri altı adet 300 μL’lik Elüsyon tamponu 1 fraksiyonunda (250 mM imidazol içeren) ve ardından 300 μL Elüsyon tamponu 2 (500 mM imidazol içeren) ile son bir elüsyon elde edin. İkinci elüsyonda, 1 mL’lik bir pipet kullanarak yukarı ve aşağı pipetleyerek reçineyi kuvvetlice çalkalayın. 6. SDS-PAGE ile Analiz NOT: Tüm elüsyon fraksiyonları, ilgilenilen proteinin miktarını ve saflığını taramak için SDS-PAGE ile analiz edilmelidir. Toplam lizat ve akışın her biri için 1 μL ve ardından toplanan tüm yıkama ve elüsyon fraksiyonları için 5 μL yükleyin.Ayrıştırılmış MOMP-tNLP’lerin, yıkamaların, akışın ve toplam lizatın alikotlarını 4x SDS-PAGE numune yükleme tamponu ile karıştırın. Aksi belirtilmedikçe numuneleri 10x numune indirgeyici ajan ile karıştırın ve ısıyla denatüre edin. Fraksiyonları, uygun bir moleküler ağırlık standardı ile birlikte 1.0 mm, %4 ila 12, 1x MES-SDS çalışma tamponlu Bis-Tris SDS-PAGE jelleri kullanarak jel elektroforezi ile analiz edin. Jelleri 200 V’ta 35 dakika çalıştırın. Jelleri üreticinin talimatlarına göre boyayın.Jeli kasetten çıkarın ve 60 mL jel lekesine yerleştirin. Jel lekesindeki jeli 30 saniye mikrodalgada ısıtın ve ısıyı eşit olarak dağıtmak için kabı 30 saniye hafifçe sallayın. Lekedeki jeli 30 saniye daha 80-85 °C’ye mikrodalgada ısıtın ve jeli 5 dakika sallamak için bir orbital çalkalayıcı üzerine yerleştirin. Jeli 30 saniye boyunca üçüncü kez mikrodalgada ısıtın ve ardından 23 dakika daha sallamak için orbital çalkalayıcıya geri dönün. Jeli temiz bir kaba aktarın ve 100 mL yıkama solüsyonunda ( metanol, %7 asetik asit) 30 dakika yıkayın.NOT: Yıkama solüsyonunun ısıtılmasını önlemek gerekli olduğundan bu kritik bir adımdır. Bunun yapılmaması, son jel görüntüsünde arka plan lekelenmesine ve düzensizliklere neden olabilir. Yıkadıktan sonra, jeli ultra saf suda iki kez 5 dakika durulayın. Jelleri 600 nm’de bir jel görüntüleyici kullanarak görüntüleyin (Şekil 2). Karşılaştırma için bir protein standardı varsa, nanopartikül çözeltisindeki tek tek protein miktarını ölçmek için SDS-PAGE’i kullanın.NOT: Bu örnekte, rekombinant olarak eksprese edilen MOMP’nin seri dilüsyonları SDS-PAGE ile çözülür ve bantların yoğunlukları enstrüman yazılımı kullanılarak ölçülür. MOMP bantlarının yoğunluklarını kullanarak standart bir eğri oluşturun. MOMP-tNLP örneklerini aynı SDS-PAGE jeli üzerinde çözün ve MOMP standart eğrisini kullanarak partiküllerin MOMP bileşenini hesaplayın (Şekil 3). 7. Batı ve nokta lekeleri ve depolama Western blotlama için, numuneleri SDS-PAGE ile çözün ve jelleri, üreticinin protokolüne göre standart ayarlara sahip ticari bir kuru kurutma sistemi kullanarak aktarın.Transfer tamamlandıktan sonra lekeleri yığından çıkarın ve her bir lekeyi gece boyunca 4 ° C’de% 0.2 Tween 20 ve 0.5 mg / mL MAb40 veya 0.2 mg / mL içeren uygun bir bloke edici tamponda inkübe edin Δ49ApoA1 proteininden His-tag’e karşı yönlendirilmiş anti-His-tag antikoru.NOT: Blotlama için kullanılan antikor dilüsyonları MAb40 için 1:1.000 ve MAbHIS antikoru için 1:500-1.000’dir. Her lekeyi PBS-T (1x PBS,% 0.2 Tween 20, pH 7.4) ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Lekeleri, 1: 10.000 seyreltmede bir florofora (örneğin, IRDye) konjuge edilmiş ikincil antikor içeren bloke edici tamponda 1 saat inkübe edin. Lekeleri PBS-T ile 5 dakika boyunca 3 kez tekrar yıkayın. Son yıkamadan sonra lekeleri görüntülemek için bir floresan görüntüleyici kullanın. Nokta lekeleri için, 3 μg saflaştırılmış MOMP-tNLP’yi kurulayın ve bir nokta leke aparatı kullanarak tNLP’yi boşaltın. Batı lekeleme için yukarıda açıklanan yöntemlerin aynısını kullanarak lekeleri bloke edin ve geliştirin. 8. Endotoksin değerlendirmesi Limulus Amebosit Lizat (LAL) testine dayalı bir endotoksin test sistemi kullanarak endotoksin seviyelerini ölçün. Endotoksin içermeyen 25 mM Tris, pH 7.4, 1 M Tris hidroklorür çözeltisi ve endotoksin içermeyen su kullanarak numune tamponu hazırlayın.NOT: Tipik olarak, numunelerin bu numune tamponu kullanılarak seyreltilmesi ve seyreltmelerin tek tek numuneler için uygun aralığı bulmak üzere ayarlanması gerekir. Burada, MOMP-tNLP numuneleri, numune tamponunda 500 kat seyreltilir ve 25 μL, 0.05 EU/mL hassasiyete sahip bir cihaz kartuşunun her bir kuyucuğuna yüklenir. Aşağıda tarif edilen fare çalışmalarında kullanılan MOMP-tNLP ve boş tNLP’nin endotoksin seviyeleri, örneğe bağlı olarak 0.4 ila 12 EU/μg protein arasındadır. 9. Liyofilizasyon MOMP-tNLP nanopartiküllerini -20 ° C’de uzun süreli (yıllara kadar) kullanım için liyofilize edin ve saklayın. Liyofilizasyon için tNLP ve MOMP-tNLP süspansiyonlarını hazırlamak için, dondurma ve liyofilizasyon işlemi sırasında koruyucu olarak trehaloz ekleyin.NOT: Bu işlem, çeşitli tNLP formülasyonları 7,8 için kapsamlı bir şekilde doğrulanmıştır. 0.1 M trehalozun nihai konsantrasyonuna ulaşmak için gereken steril, endotoksin içermeyen, deiyonize suda 1 M trehaloz hacmini elde etmek için MOMP-tNLP çözeltisinin mevcut hacmini 9’a bölün. Son hacmi not edin ve istediğiniz gibi endotoksin içermeyen 15 mL veya 50 mL polipropilen tüplere alın. Karışık çözeltiyi kuru buz üzerinde dondurun ve bir liyofilizatör kullanarak gece boyunca liyofilize edin. Kurutulmuş formülasyonları ihtiyaç duyulana kadar -20 °C’de saklayın. Endotoksin içermeyen su kullanarak liyofilize tNLP’leri sulandırın. Liyofilize kek tamamen eriyene ve yeniden sulandırılana kadar yavaşça yuvarlayın. Trehalozu çıkarmak için, 3.5 kDa’lık bir kesme diyaliz membranı kullanarak çözeltiyi PBS’ye karşı diyalize edin. 10. Adjuvan ilavesi NOT: Bu ve diğer benzer NLP bazlı alt birim aşı formülasyonları, CpG-ODN1826 ve FSL-1 gibi lipofilik adjuvanları kolayca içerebilir. CpG-ODN1826, 5′ kolesterol parçasına (5′-chol-C6) sahip tam bir fosforotiyoat omurgasına sahip, modifiye edilmiş bir B Sınıfı CpG oligonükleotididir (5′-tccatgacgttcctgacgtt-3′). CpG-ODN1826’in tNLP’lere konjugasyonuna, kolesterol kısmı ile tNLP’nin fosfolipid çift tabakası arasındaki hidrofobik etkileşimler aracılık eder ve daha önce bildirildiği gibi gösterilmiş ve iyi karakterize edilmiştir 9,10. Bu formülasyonlara dahil edilmeden önce, kirletici endotoksini ve modifiye edilmemiş CpG moleküllerini uzaklaştırmak için kolesterolü değiştirilmiş CpG’yi ters faz kromatografisi ile saflaştırın.Satıcıdan alındıktan sonra, liyofilize CpG malzemesini endotoksin içermeyen suda rehidre edin ve 10 mM trietilamonyum asetat (TEAA) (mobil faz A) ve asetonitrilden (mobil faz B) oluşan bir ayırma gradyanı kullanarak hazırlayıcı bir C4 RP-HPLC kolonunda saflaştırın.NOT: Ek ayrıntılar Tablo 2’de mevcuttur. Kolesterolü modifiye edilmiş CpG içeren fraksiyonları bir araya getirin ve liyofilize edin. Kalıntı TEAA’nın tamamen uzaklaştırılmasını sağlamak için, CpG’yi 15 mL endotoksin içermeyen su ile sulandırın ve üç kez yeniden liyofilize edin. Son liyofilizasyondan sonra, CpG’yi endotoksin içermeyen suda (>20 mg / mL nihai CpG konsantrasyonu), alikotta yeniden sulandırın ve ihtiyaç duyulana kadar -80 ° C’de saklayın. Formülasyonlara ek olarak, CpG’yi 1-2.5 mg/mL’lik bir konsantrasyona seyreltin.NOT: FSL-1, aşı sınıfı, liyofilize toz olarak mevcuttur. Bu, 1 mg / mL konsantrasyonda steril ve endotoksin içermeyen su kullanılarak sulandırılır. Aşı, her doz toplam 50 μL hacimde 10 μg MOMP içerecek şekilde kas içine (i.m.) uygulanır. İstenen formülasyon dozunu elde etmek için, nanopartikülleri PBS’ye diyalize edin ve adjuvan ilavesinden önce santrifüjlü bir vakum yoğunlaştırıcı kullanarak konsantre edin. Numunenin tamamen kurumasını önlemek için bunu yaparken dikkatli olun – santrifüjleme sırasında numune hacmini her 20-30 dakikada bir kontrol edin. Adjuvanı steril koşullar altında bir biyogüvenlik kabinine ekleyin. Başarılı birleştirmeyi değerlendirmek için, nihai formülasyonları ve bileşenlerini analitik boyut dışlama kromatografisi (SEC) ile analiz edin.NOT: Bu preparatlar için, PBS tamponunda (akış hızında 0.5 mL/m) bir SEC kolonu kullanıldı ve bir UV-vis diyot dizi detektörü kullanılarak elüsyon tespit edildi. Birleşme, adjuvanlı parçacıkların absorpsiyonu 214 ve 280 nm’de adjuvansız parçacıklarınkiyle karşılaştırılarak değerlendirildi. Adjuvanlı MOMP-tNLP’yi ve boş tNLP’yi hayvan kullanımından önce 4 ° C’de 14 güne kadar saklayın. Yeni bir tNLP formülasyonunun stabilitesini tam olarak değerlendirmek için, depolanan tNLP’leri SEC tarafından periyodik olarak analiz edin.NOT: Stabilite formülasyondan formülasyona değişecektir. 11. Serum testi 3 haftalık dişi fareler elde edin (BALB/c, n = 6). Fareleri her bir arka bacakta kas içi (i.m.) 5 μg CpG ve 1 μg FSL-1 (enjeksiyon başına toplam hacim = 50 mL) ile adjuvanlı MOMP-tNLP formunda 10 μg MOMP ile aşılayın. Aşılamadan sonra, fareleri sternal yaslamayı koruyana kadar gözlemleyin. İlk aşılamadan dört hafta sonra (prime), hayvanları 5 μg CpG ve 1 μg FSL-1 (enjeksiyon başına toplam hacim = 50 mL) ile adjuvanlı MOMP-tNLP formunda 10 μg MOMP ile ikinci kez (boost) aşılayın. İlk aşılamadan sonraki 56. günde, antikor titrelerini değerlendirmek için kan toplayın. Bir ksilazin (0.3 mg / 20 g vücut ağırlığı) ve ketamin (3.0 mg / 20 g vücut ağırlığı) çözeltisi enjekte ederek fareleri uyuşturarak başlayın. Sarsıntı olmadığından emin olmak için ön ve arka ayakları sıkıştırın. Anestezi sırasında göz kuruluğunu önlemek için göz çevresine vazelin uygulayın. Bir mikro-hematokrit kılcal tüp kullanarak, retro-orbital pleksusu delin. Bir mikrosantrifüj tüpünde 100 mL kan toplayın. Kan alındıktan sonra, fareleri anesteziden kurtulana ve sternal yaslığı koruyana kadar gözlemleyin. Kanın oda sıcaklığında 30 dakika pıhtılaşmasına izin verin ve ardından 10 dakika boyunca 2.000 × g’da dönün. Serumu toplayın ve -80 °C’de dondurun. Şu anda, hayvanlara Chlamydia muridarum ile meydan okuyun veya ötenazi yapın. Farelere önce bir ksilazin (0.3 mg / 20 g vücut ağırlığı) ve ketamin (3.0 mg / 20 g vücut ağırlığı) çözeltisi enjekte ederek ötenazi yapın, ardından servikal çıkık. Yukarıda tarif edildiği gibi batı blotlama tekniklerini kullanarak MOMP’ye özgü serum antikorlarını test edin. Tüm aşılanmış farelerden havuz faresi serumları ve havuzlanmış serumu 1: 5.000 seyreltmede birincil antikor yerine kullanın.