用于疫苗开发的无细胞规模生产和对来自 穆里达鲁姆衣原 体的重组主要外膜蛋白的佐剂添加

所有动物研究均在加州大学欧文分校根据机构动物护理和使用委员会制定的指导方针在公共卫生服务（PHS）保证的设施中进行。 1. 玻璃器皿制备 注意：用于生产动物疫苗级配方的所有材料均不含内毒素。 为了破坏污染的内毒素，烘烤清洁的玻璃器皿，这些玻璃器皿将在180°C的烤箱中保持缓冲液4小时。 2. 缓冲液制备 制备表 1中列出的250 mLNi亲和纯化缓冲液。将它们在4°C下储存长达6个月。 3. 反应制备 称取 20 mg 1,2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱 （DMPC） 放入无内毒素的 1.5 mL 离心管中。将其溶解在 1 mL 无内毒素水中，在 6 A 下探头超声处理至少四次，持续 1 分钟，中间暂停 1 分钟，直至澄清。通过在22°C下以13,000× g 离心2分钟，从探针中除去任何污染物金属，然后将溶解的脂质转移到新的1.5mL无内毒素管中。 称出 1 mg PEG5k-CA8 端胶质放入 1.5 mL 无内毒素管中。溶于无内毒素水中，浓度为20毫克/毫升。涡旋直至完全溶解并稀释至 2 mg/mL。 在新的无内毒素管中，将 210 μL 20 mg/mL DMPC 溶液与 210 μL 2 mg/mL 端胶质溶液混合。 4. 用于亚单位疫苗制剂的 MOMP-tNLP 的无细胞生产 使用从先前发布的方案修改的无细胞方法制备 MOMP-tNLP5。在建立无细胞反应前两小时，打开原核无细胞蛋白表达试剂盒并解冻其中一个复溶缓冲液。解冻后，加入一片不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合物，使其完全溶解。 使用设计用于运行 5 x 1 mL 反应的试剂盒遵循此方案。注意：典型的放大生产量为 3 x 1 mL。对于每 1 mL 反应，向 大肠杆菌 裂解物瓶中加入 525 μL 复溶缓冲液，然后轻轻滚动以溶解。将 250 μL 复溶缓冲液加入含有反应添加剂（例如 ATP、GTP）的瓶中，轻轻滚动溶解。 向反应进料瓶中加入 8.1 mL 复溶缓冲液，用橡胶塞盖上盖子（注意不要接触橡胶塞的内部），然后轻轻倒置/滚动以溶解。 将 3 mL 复溶缓冲液加入氨基酸混合物瓶中，用橡胶塞盖上盖子，然后轻轻倒置/滚动以溶解。注意：注意不要触摸橡胶塞的内部，因为这会导致污染。 将 1.8 mL 复溶缓冲液加入蛋氨酸瓶中，轻轻滚动溶解，然后储存在冰上直至使用。 制备反应溶液。向 大肠杆菌 裂解物瓶中加入 225 μL 重构反应混合物、270 μL 不含蛋氨酸的重组氨基酸混合物和 30 μL 重组蛋氨酸。此外，加入 400 μL DMPC/端胶质体混合物、15 μg MOMP 质粒和 0.6 μg Δ49ApoA1 质粒。滚动/轻轻摇晃以混合。注意：确保两个质粒均由相同的质粒骨架构建。不要涡旋。 取 20 μL 总溶液，放在 1.5 mL 管中，用于表达 GFP 的对照反应（见下文）。 准备饲料溶液。向饲料混合物瓶中加入 2.65 mL 不含蛋氨酸的重组氨基酸混合物和 300 μL 重组蛋氨酸。滚动/轻轻摇晃以溶解。注意：此时，未使用的复溶缓冲液和蛋氨酸可以返回冰箱储存。 将 1 mL 的反应溶液转移到无细胞反应试剂盒中提供的内反应室中，并在填充时密封。将 10 mL 的进料溶液转移到反应容器的外室并密封。注意：不要把腔室装得太满！内部反应室和内部进料室顶部的气泡会对反应产生不利影响。任何剩余的反应溶液都可以放入 1.5 mL 管中，并让其与主容器一起混合。 向先前等分的20 μL反应混合物中加入0.5 μLGFP对照质粒（0.5 mg/mL）。注意：许多试剂盒随附对照质粒，用于质量控制目的。大多数具有T7启动子和 大肠杆菌 核糖体结合位点（RBS）的表达GFP的质粒也可以用作对照质粒。 将反应物置于300rpm，30°C的振荡器中长达18小时。为了验证反应是否成功，在孵育15分钟后，使用紫外光源检查由于对照GFP（图1A）的合成而产生的荧光。注意：这些条件，特别是温度，可能需要针对其他膜蛋白的表达进行优化。 5. 单核糖核素纯化 使用固定化镍亲和色谱法使用 Δ49ApoA1 蛋白上的 His-tag 从无细胞反应混合物中纯化 MOMP-tNLP 纳米颗粒复合物。将 1 mL 50% His-Tag 纯化树脂浆液转移到一次性 10 mL 色谱柱中，并用 3 mL 结合缓冲液进行平衡。 让缓冲液沥干，盖上出口，并向树脂中加入 250 μL 结合缓冲液。 在将无细胞反应添加到色谱柱之前，保存20 μL以供以后通过SDS-PAGE进行分析。将无细胞反应与平衡树脂混合，并将其在实验室摇臂上于4°C孵育1小时。 打开色谱柱的盖子，用500 μL额外的结合缓冲液洗涤瓶盖，然后将该液体添加到色谱柱的其余部分。 从色谱柱中收集液体流出物，以便以后通过SDS-PAGE进行分析。 用含有20 mM咪唑的1 mL洗涤缓冲液洗涤色谱柱6次并收集馏分。注意不要让树脂在两次洗涤之间变干。在第二次洗涤时，使用 1 mL 移液器上下移液剧烈搅拌树脂。 在六个 300 μL 洗脱缓冲液 1（含有 250 mM 咪唑）中洗脱 MOMP-tNLP，然后用 300 μL 洗脱缓冲液 2（含有 500 mM 咪唑）进行最后一次洗脱。在第二次洗脱时，使用 1 mL 移液器上下移液剧烈搅拌树脂。 第6章 SDS-PAGE的分析 注意：所有洗脱级分都应通过SDS-PAGE进行分析，以筛选目标蛋白质的数量和纯度。 总裂解物和流通液各上样 1 μL，然后对所有收集的洗涤液和洗脱级分上样 5 μL。将洗脱的 MOMP–tNLP、洗涤液、流通液和总裂解液的等分试样与 4x SDS-PAGE 上样缓冲液混合。除非另有说明，否则用10倍样品还原剂混合并热变性样品。 使用1.0 mm，4至12%，Bis-Tris SDS-PAGE凝胶和1x MES-SDS电泳缓冲液以及适当的分子量标准品通过凝胶电泳分析馏分。在200 V下运行凝胶35分钟。 按照制造商的说明对凝胶进行染色。从凝胶盒中取出凝胶，并将其放入 60 mL 凝胶染色剂中。将凝胶在凝胶染色剂中微波30秒，轻轻摇动容器30秒以均匀分布热量。将染色剂中的凝胶微波至80-85°C再加热30秒，然后将凝胶放在轨道振荡器上摇动5分钟。 第三次微波凝胶30秒，然后返回轨道摇床再摇动23分钟。 将凝胶转移到干净的容器中，并在100mL洗涤溶液（10%甲醇，7%乙酸）中洗涤30分钟。注意：这是一个关键步骤，因为必须避免加热洗涤溶液。否则可能会导致背景染色和最终凝胶图像的不规则。 洗涤后，用超纯水冲洗凝胶两次，每次5分钟。 使用凝胶成像仪在600 nm处对凝胶进行成像（图2）。如果有用于比较的蛋白质标准品，请使用SDS-PAGE量化纳米颗粒溶液中单个蛋白质的量。注意：在本例中，重组表达的MONP的连续稀释液通过SDS-PAGE解析，并使用仪器软件定量条带的密度。 使用 MOMP 波段的密度生成标准曲线。在同一SDS-PAGE凝胶上分离MOMP-tNLP样品，并使用MONP标准曲线计算颗粒的MONP成分 （图3）。 7. 蛋白质和点印迹和储存 对于蛋白质免疫印迹，通过SDS-PAGE分离样品，并使用商业干转系统转移凝胶，该系统根据制造商的方案进行标准设置。转印完成后从堆栈中取出印迹膜，并将每个印迹在含有0.2%吐温20和0.5 mg/mL MAb40或0.2 mg/mL MAbHIS抗His标签的合适封闭缓冲液中孵育过夜，靶向来自Δ49ApoA1蛋白的His标签。注意：用于印迹的抗体稀释度对于MAb40为1：1,000，对于MAbHIS抗体为1：500–1,000。 用PBS-T（1x PBS，0.2%吐温20，pH 7.4）洗涤每个印迹3次5分钟。 将印迹在含有与荧光团（例如IRDye）偶联的二抗的封闭缓冲液中以1：10,000稀释度孵育1小时。 用PBS-T重新洗涤印迹3次5分钟。使用荧光成像仪在最后一次洗涤后对印迹进行成像。 对于斑点印迹，使用点印迹仪印迹3μg纯化的MOMP-tNLP和空tNLP。使用上述蛋白质印迹的相同方法封闭和显影印迹。 8. 内毒素评估 使用基于鲎变形细胞裂解物 （LAL） 测定的内毒素检测系统量化内毒素水平。使用1 M Tris盐酸盐溶液和无内毒素水制备无内毒素25 mM Tris，pH 7.4，样品缓冲液。注意：通常，需要使用此样品缓冲液稀释样品，并调整稀释度以找到适合单个样品的范围。在这里，MOMP-tNLP 样品在样品缓冲液中稀释 500 倍，并以 0.05 EU/mL 灵敏度将 25 μL 加载到设备盒的每个孔中。下面描述的小鼠研究中使用的MOMP-tNLP和空tNLP的内毒素水平在0.4至12EU/μg蛋白质之间，具体取决于样品。 9. 冻干 冻干并储存MOMP-tNLP纳米颗粒，以便在-20°C下长期（长达数年）使用。 为了制备用于冻干的tNLP和MOMP-tNLP悬浮液，请在冷冻和冻干过程中加入海藻糖作为保护剂。注意：该过程已针对各种tNLP制剂7,8进行了广泛验证。 将MOMP-tNLP溶液的当前体积除以9，以获得达到0.1M海藻糖终浓度所需的无菌，无内毒素去离子水中的1M海藻糖体积。记下最终体积，并根据需要等分到无内毒素的 15 mL 或 50 mL 聚丙烯管中。 将混合溶液冷冻在干冰上，并使用冻干机冻干过夜。将干燥的制剂储存在-20°C直至需要。 使用无内毒素水重建冻干的tNLP。轻轻滚动，直到冻干蛋糕完全溶解并重新水化。要去除海藻糖，请使用 3.5 kDa 截止透析膜对溶液进行 PBS 透析。 10. 佐剂添加 注意：这些和其他类似的基于NLP的亚单位疫苗制剂可以很容易地加入亲脂性佐剂，如CpG-ODN1826和FSL-1。CpG-ODN1826是一种修饰的B类CpG寡核苷酸（5′-tccatgacgttcctgacgtt-3’），具有完整的硫代磷酸骨架，具有5’胆固醇部分（5′-chol-C6）。CpG-ODN1826与tNLP的偶联是由tNLP的胆固醇部分和磷脂双层之间的疏水相互作用介导的，并且已经得到证明和很好的表征，如先前报道的9,10。 在掺入这些配方之前，通过反相色谱纯化胆固醇修饰的CpG，以去除污染的内毒素以及任何未修饰的CpG分子。从供应商处收到后，将冻干的CpG材料在无内毒素水中再水化，并使用由10 mM三乙基乙酸铵（TEAA）（流动相A）和乙腈（流动相B）组成的分离梯度在制备型C4 RP-HPLC色谱柱上纯化。注： 表 2 中提供了更多详细信息。 汇集并冻干含有胆固醇修饰的CpG的馏分。为确保完全去除残留的TEAA，请用15 mL无内毒素水复溶CpG并重新冻干三次。 最终冻干后，在无内毒素水（>20 mg / mL最终CpG浓度）中复溶CpG，等分试样，并将其储存在-80°C直至需要。除配方外，将 CpG 稀释至 1–2.5 mg/mL 的浓度。注意：FSL-1 可作为疫苗级冻干粉末提供。使用浓度为1mg / mL的无菌和无内毒素水进行复溶。疫苗肌肉内（i.m.）给药，每剂含有10μgMONP总体积为50μL。 为了达到所需的制剂剂量，将纳米颗粒透析到PBS中，并在添加佐剂之前使用离心真空浓缩器将其浓缩。这样做时要小心，以防止样品完全干燥——离心过程中每 20-30 分钟检查一次样品体积。 在无菌条件下将佐剂添加到生物安全柜中。为了评估掺入的成功，请通过分析体积排阻色谱（SEC）分析最终配方及其组分。注意：对于这些制备，在PBS缓冲液中使用SEC色谱柱（流速为0.5 mL / m），并使用紫外-可见二极管阵列检测器检测洗脱。通过将佐剂颗粒的吸收与214和280nm处的未佐剂颗粒的吸收进行比较来评估掺入。 在动物使用前将佐剂MOMP-tNLP和空tNLP储存在4°C下长达14天。为了全面评估新tNLP配方的稳定性，SEC定期分析存储的tNLP。注意：稳定性因配方而异。 11. 血清检测 获得雌性3周龄小鼠（BALB / c，n = 6）。 在每个后肢肌内（im）用10μgMOMP形式用5μgCpG和1μgFSL-1佐剂佐剂的MOMP-tNLP形式（im）接种小鼠。 接种疫苗后，观察小鼠，直到它们能够保持胸骨卧位。 初次接种（初配）四周后，用 10 μg MOMP 以 MOMP-tNLP 的形式第二次（加强）接种动物，佐剂为 5 μg CpG 和 1 μg FSL-1（每次注射的总体积 = 50 mL）。 在初次接种疫苗后第 56 天，收集血液以评估抗体滴度。首先通过注射甲苯噻嗪（0.3mg / 20g体重）和氯胺酮（3.0mg / 20g体重）的溶液来麻醉小鼠。捏住前腿和后腿，确保不会发生抽搐。在眼睛周围涂抹凡士林，以防止麻醉期间眼睛干燥。 使用微血细胞比容毛细管，穿刺眶后丛。在微量离心管中收集 100 mL 血液。 采血后，观察小鼠，直到它们从麻醉中恢复并可以保持胸骨卧位。 让血液在室温下凝结30分钟，然后以2,000 ×g 旋转10分钟。收集血清并在-80°C冷冻。 此时，用 穆里达鲁衣原体 挑战动物或对它们实施安乐死。通过首先腹膜注射甲苯噻嗪（0.3mg / 20g体重）和氯胺酮（3.0mg / 20g体重）的溶液，然后颈椎脱位，对小鼠实施安乐死。 如上所述，使用蛋白质印迹技术检测 MOMP 特异性血清抗体。汇集来自所有免疫小鼠的小鼠血清，并使用混合血清代替1：5,000稀释的一抗。