On-chip kristallisatie en grootschalige seriële diffractie bij kamertemperatuur

Vanwege de ioniserende effecten van röntgenstraling is eiwitkristallografie in de afgelopen drie decennia voor een groot deel beperkt gebleven tot cryogene omstandigheden. Daarom komt de huidige kennis van eiwitbewegingen tijdens zijn functie grotendeels voort uit vergelijkingen tussen statische structuren die in verschillende toestanden onder cryogene omstandigheden worden waargenomen. Cryogene temperaturen belemmeren echter onvermijdelijk de progressie van een biochemische reactie of interconversie tussen verschillende conformatietoestanden terwijl eiwitmoleculen aan het werk zijn. Om de structurele dynamiek van eiwitten direct te observeren bij atomaire resolutie door kristallografie, zijn robuuste en routinematige methoden nodig voor het uitvoeren van diffractie-experimenten bij kamertemperatuur, wat technische innovaties vereist in monsterafgifte, gegevensverzameling en posterieure gegevensanalyse. Daartoe hebben recente ontwikkelingen in seriële kristallografie nieuwe mogelijkheden geboden om de moleculaire beelden van tussenproducten en kortlevende structurele soorten bij kamertemperatuur ^1,2,3 vast te leggen. In tegenstelling tot de “one-crystal-one-dataset”-strategie die veel wordt gebruikt in conventionele cryocrystallografie, hanteert seriële kristallografie een strategie voor gegevensverzameling die vergelijkbaar is met die van cryo-elektronenmicroscopie met één deeltje. In het bijzonder worden de experimentele gegevens in seriële kristallografie verzameld in kleine fracties van een groot aantal individuele monsters, gevolgd door intensieve gegevensverwerking waarbij gegevensfracties worden geëvalueerd en gecombineerd tot een volledige dataset voor 3D-structuurbepaling⁴. Deze “one-crystal-one-shot” strategie verlicht effectief de röntgenstralingsschade aan eiwitkristallen bij kamertemperatuur via een diffractie vóór vernietigingsstrategie⁵.

Aangezien seriële kristallografie een groot aantal eiwitkristallen vereist om een dataset te voltooien, vormt dit grote technische uitdagingen voor veel biologische systemen waar eiwitmonsters beperkt zijn en / of delicate kristalverwerking betrokken is. Een andere belangrijke overweging is hoe de kristalintegriteit het beste kan worden bewaard in seriële diffractie-experimenten. De in situ diffractiemethoden pakken deze zorgen aan door eiwitkristallen rechtstreeks te laten diffracteren van waar ze groeien zonder de verzegeling van de kristallisatiekamer^{te verbreken 6,7,8,9}. Deze handlingvrije methoden zijn natuurlijk compatibel met grootschalige seriële diffractie. We hebben onlangs het ontwerp en de implementatie gemeld van een kristallisatie-apparaat voor in situ diffractie op basis van een kristal-op-kristalconcept – eiwitkristallen die rechtstreeks op monokristallijn kwarts^{zijn gekweekt 11}. Dit “kristal-op-kristal” apparaat biedt verschillende voordelen. Ten eerste beschikt het over een röntgen- en lichttransparant venster gemaakt van een monokristallijn kwartssubstraat, dat weinig achtergrondverstrooiing produceert, wat resulteert in uitstekende signaal-ruisverhoudingen in diffractiebeelden van eiwitkristallen. Ten tweede is het kwarts met één kristal een uitstekend dampscherm dat gelijkwaardig is aan glas, waardoor het een stabiele omgeving biedt voor eiwitkristallisatie. Daarentegen zijn andere kristallisatieapparaten die op polymeren gebaseerde substraten gebruiken gevoelig voor droging als gevolg van dampdoorlaatbaarheid, tenzij het polymeermateriaal een aanzienlijke dikte heeft, wat bijgevolg bijdraagt aan een hoge achtergrondverstrooiing¹⁰. Ten derde maakt dit apparaat de levering van een groot aantal eiwitkristallen aan de röntgenstraal mogelijk zonder enige vorm van kristalmanipulatie of oogsten, wat van cruciaal belang is voor het behoud van de kristalintegriteit¹¹.

Om seriële röntgendiffractie-experimenten met behulp van de kristal-op-kristalapparaten te stroomlijnen, hebben we een diffractometerprototype ontwikkeld om eenvoudig schakelen tussen de optische scan- en röntgendiffractiemodi^{12 te} vergemakkelijken. Deze diffractometer heeft een kleine voetafdruk en is gebruikt voor seriële gegevensverzameling op twee bundellijnen van de Advanced Photon Source (APS) in het Argonne National Laboratory. Specifiek gebruikten we BioCARS 14-ID-B voor Laue-diffractie en LS-CAT 21-ID-D voor monochromatische oscillatie. Deze diffractometerhardware is niet vereist als een synchrotron- of röntgenvrije elektronenlaserbundellijn is uitgerust met twee belangrijke mogelijkheden: (1) gemotoriseerde monsterpositionering met een reisbereik van ±12 mm rond de röntgenstraal in alle richtingen; en (2) een on-axis digitale camera voor het bekijken van kristallen onder lichtverlichting die veilig is voor eiwitkristallen die worden bestudeerd. Het monokristallijne kwartsapparaat vormt samen met een draagbare diffractometer en de besturingssoftware voor optische scanning, kristalherkenning en geautomatiseerde in situ gegevensverzameling gezamenlijk het inSituX-platform voor seriële kristallografie. Hoewel deze ontwikkeling voornamelijk wordt gemotiveerd door de dynamische kristallografietoepassingen met behulp van een polychromatische röntgenbron, hebben we het potentieel van deze technologie aangetoond om monochromatische oscillatiemethoden te ondersteunen^10,12. Met automatisering biedt dit platform een methode voor het verzamelen van seriële gegevens met hoge doorvoer bij kamertemperatuur met betaalbaar eiwitverbruik.

In deze bijdrage beschrijven we in detail hoe we on-chip kristallisatie in een nat laboratorium kunnen instellen en hoe we seriële röntgengegevensverzameling kunnen uitvoeren op een synchrotron-bundellijn met behulp van het inSituX-platform.

De batchmethode wordt gebruikt om on-chip kristallisatie in te stellen onder een toestand die vergelijkbaar is met die van de dampdiffusiemethode die voor hetzelfde eiwitmonster is verkregen (tabel 1). Als uitgangspunt raden we aan om precipitant te gebruiken met een concentratie van 1,2-1,5x daarvan voor de dampdiffusiemethode. Indien nodig kan de kristallisatieconditie van de batch verder worden geoptimaliseerd via fijnrasterscreening. Kwartswafers zijn niet nodig voor optimalisatieproeven; in plaats daarvan kunnen glazen coverslips worden gebruikt (zie hieronder). Gedeeltelijk geladen kristallisatieapparaten worden aanbevolen om optimalisatieproeven op kleinere schaal te houden. Een aantal eiwitmonsters is met succes gekristalliseerd op dergelijke apparaten met behulp van de batchmethode¹⁰ (tabel 1).

Het apparaat zelf bestaat uit de volgende onderdelen: 1) een buitenste ring; 2) twee kwartswafers; 3) een wasmachine-achtige shim van plastic of roestvrij staal; 4) een keerring; 5) microscoop-dompelolie als afdichtmiddel (figuur 1). Het totale volume van de kristallisatieoplossing die op één chip wordt geladen, is afhankelijk van het doel van het experiment. De capaciteit van de kristallisatiekamer kan worden aangepast door een shim van verschillende diktes en /of binnendiameter te kiezen. We zetten routinematig kristallisatieapparaten op met een capaciteit van 10-20 μL met behulp van shims van 50-100 μm in dikte. Een typisch apparaat kan tienduizenden tot duizenden eiwitkristallen produceren die geschikt zijn voor seriële gegevensverzameling (figuur 2).

Wanneer succesvol, zal on-chip kristallisatie tientallen tot honderden of zelfs duizenden eiwitkristallen produceren op elk kwartsapparaat dat klaar is voor röntgendiffractie. Bij een synchrotronbundellijn wordt een dergelijk apparaat met behulp van een kinematisch mechanisme op een drieassige translatiefase van de diffractometer gemonteerd. Het kristallisatievenster van een gemonteerd apparaat wordt optisch gescand en afgebeeld in tientallen tot honderden microfoto’s. Deze microfoto’s worden vervolgens gestikt tot een montage met hoge resolutie. Voor lichtgevoelige kristallen kan optisch scannen worden uitgevoerd onder infrarood (IR) licht om onbedoelde foto-activering te voorkomen. Er is computer vision-software ontwikkeld om eiwitkristallen te identificeren en te lokaliseren die willekeurig op het apparaat zijn verdeeld. Deze kristallen worden vervolgens gerangschikt op basis van hun grootte, vorm en positie om de strategie voor gegevensverzameling in seriële kristallografie te informeren of te begeleiden. Er kunnen bijvoorbeeld enkele of meerdere opnamen op elk gericht kristal worden gevonden. Gebruikers konden een enkele pas of meerdere routes door gerichte kristallen plannen. We hebben software geïmplementeerd om verschillende reisroutes te berekenen. De kortste route wordt bijvoorbeeld berekend met behulp van algoritmen die het probleem van de reizende verkoper aanpakken¹³. Voor pomp-sonde dynamische kristallografische toepassingen kunnen de timing en duur van laser(pomp) en röntgenfoto’s (sonde) worden gekozen. Een geautomatiseerde seriële gegevensverzameling is geprogrammeerd om elk gericht kristal achter elkaar in de röntgenstraal te transloceren.

De belangrijkste componenten van de insituX diffractometer zijn: 1) een apparaathouder; 2) een drieassige vertaalfase; 3) een lichtbron voor optisch scannen; 4) een röntgenstraalstop; 5) pomplasers als lichtgevoelige eiwitten worden bestudeerd; 6) Raspberry Pi microcomputer uitgerust met een IR-gevoelige camera; 7) besturingssoftware om motoren, camera, lichtbronnen, pomplaser te synchroniseren en te communiceren met beamline-bedieningselementen.