إعداد العينة باستخدام طريقة أحادية الطبقة الدهون للدراسات البلورية الإلكترون
Summary
وقد استخدمت monolayers الدهون كأساس لتشكيل بلورات البروتين ثنائي الأبعاد (2D) للدراسات الهيكلية لعقود. فهي مستقرة في واجهة الهواء والماء ويمكن أن تكون بمثابة مادة داعمة رقيقة للتصوير الإلكتروني. هنا نقدم الخطوات المثبتة على إعداد monolayers الدهون للدراسات البيولوجية.
Abstract
علم البلورات الإلكترونية هو أداة قوية لتحديد هيكل عالية الدقة. يمكن زراعة الجزيئات الكبيرة مثل البروتينات القابلة للذوبان أو الأغشية إلى بلورات ثنائية الأبعاد (ثنائية الأبعاد) مرتبة للغاية في ظل ظروف مواتية. نوعية بلورات 2D نمت أمر بالغ الأهمية لقرار إعادة الإعمار النهائي عن طريق معالجة الصور 2D. على مر السنين، استخدمت monolayers الدهون كطبقة داعمة لتعزيز بلورة 2D من بروتينات الغشاء المحيطي، فضلا عن البروتينات القابلة للذوبان. ويمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة على بلورة ثنائية الأبعاد لبروتينات الأغشية المتكاملة ولكنها تتطلب إجراء تحقيق تجريبي أكثر شمولا لتحديد المنظفات وظروف غسيل الكلى لتعزيز التقسيم إلى طبقة أحادية. تتشكل طبقة أحادية الدهون في واجهة الهواء والماء بحيث تظل مجموعات رأس الدهون القطبية رطبة في المرحلة المائية وتقسم سلاسل acyl غير القطبية والذيول إلى الهواء ، مما يكسر التوتر السطحي ويسطح سطح الماء. توفر الطبيعة المشحونة أو moieties الكيميائية المميزة للمجموعات الرأسية تقاربا للبروتينات في المحلول ، مما يعزز الربط لتشكيل الصفيف 2D. يمكن نقل طبقة أحادية تم تشكيلها حديثا مع الصفيف ثنائي الأبعاد بسهولة إلى المجهر الإلكتروني (EM) على شبكة نحاسية مغلفة بالكربون تستخدم لرفع ودعم الصفيف البلوري. في هذا العمل، ونحن نصف منهجية أحادية الطبقة الدهون للتصوير المجهري الإلكتروني المبردة (cryo-EM).
Introduction
يمكن أن يحقق الحيود الإلكتروني من خلال بلورات 2D أو صفائف حلية من البروتينات دقة دون نانومتر في الحالات المواتية1و2و3. من أهمية خاصة هي إعادة تشكيلها صفائف البروتين غشاء 2D أو بلورات في بيئاتها شبه الأصلية1. ولأن الكريستال يعمل كمضخم إشارة يعزز شدة العوامل الهيكلية على ترددات مكانية محددة، فإن علم البلورات الإلكترونية يسمح بالتحقيق في هدف بحجم أصغر بدقات عالية، مثل الجزيئات الصغيرة، من تلك الخاصة بالتبريد-EM أحادي الجسيمات. يمكن أن ينتشر شعاع الإلكترون من خلال مجموعة بروتينات 2D مرتبة ، مما يولد نمطا للانعراج أو صورة شعرية اعتمادا على مكان تسجيل مستوى الصورة على الكاشف4. ويمكن بعد ذلك استخراج الكثافات المنتشرة ومعالجتها لإعادة بناء هيكل إسقاط 2D من الكريستال. الإلكترونات لديها أكبر تشتت المقطع العرضي من الأشعة السينية وتشتتها يتبع في الغالب نموذج رذرفورد على أساس التفاعل كولومب بين الإلكترونات والذرات المشحونة في جزيء5. سمك بلورات الغشاء ثنائي الأبعاد عادة ما تكون أقل من 100 نانومتر، ومناسبة لانتقال الإلكترون دون التشتت الديناميكي الذي يحدث داخل العينة6. وقد ثبت أن الدراسات البلورية الإلكترونية أداة قوية للتحقيق في المعلومات الهيكلية عالية الدقة من بروتينات الأغشية والتفاعلات البروتين الدهني7،8،9،10،11،12،13،14،15،16،17.
و monolayer الدهون هي طبقة واحدة من الدهون تتكون من فوسفوليبيدات معبأة بكثافة في واجهة الهواء والماء6، والتي يمكن أن تساعد في تشكيل صفيف 2D للبروتينات القابلة للذوبان أو بروتينات الغشاء المحيطي18. اعتمادا على كثافة الدهون وضغطها الجانبي ، يمكن أن تشكل جزيئات الدهون صفيفا ثنائي الأبعاد مرتبا على واجهة الهواء والماء مع سلاسل أسيل الممتدة إلى الهواء ومجموعات الرأس الهيدروفيلية المكشوفة في المحلول المائي1و6و19. يمكن أن تتفاعل المجموعة الرأسية الدهنية مع البروتينات عن طريق التفاعل الكهروستاتيكي أو يمكن تعديلها لتوفير علامة تقارب لربط مجال بروتين معين. على سبيل المثال، وDINGS-NTA-Ni (1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl]2- Ni 2+) غالبا ما يستخدم في تشكيل أحادي الطبقة الدهنية لربط البروتينات مع علامة البولي هيستيدين20،21،22. أيضا ، يمكن للسموم الكوليرا B ربط pentasaccharide معينة من gm1 ganglioside في monolayer الدهون للدراسات الهيكلية23،24. من خلال ترسيخ البروتينات على مجموعات الرأس الدهنية ، يمكن أن تساعد الطبقة الأحادية الدهنية في تكوين الصفائف 2D الرقيقة للدراسات البلورية الإلكترونية عالية الدقة. وقد استخدمت تقنية monolayer الدهون في علم البلورات الإلكترونية للدراسات الهيكلية للبروتينات، مثل streptavidin2،25، annexin V26، الكوليرا السم27، E. coli gyrase B subunit28، E. coli RNA polymerase25،29،30، carboxysome قذيفة البروتينات31 والبروتينات capsid من فيروس نقص المناعة البشرية –1 32 ومولوني مورين فيروس سرطان الدم 33.نظرا للاستقرار والخصائص الكيميائية للدهون monolayer، وقد تم استكشاف تطبيقات مختلفة لإعداد عينة للتصوير cryo-EM34. ومع ذلك، سوف تكون هناك حاجة إلى التحسين لتشكيل صفيف البروتين.
هنا، ونحن نقدم تفاصيل مستفيضة عن الإعداد العام من monolayers الدهون للتصوير cryo-EM وبعض الاعتبارات التي يمكن أن تؤثر على نوعية monolayers شكلت.
Protocol
Representative Results
Discussion
طبقة أحادية الدهون هي أداة قوية تسهل نمو بلورات كبيرة 2D للدراسات الهيكلية للجزيئات الكبيرة البيولوجية. لإعداد طبقة أحادية الدهون سليمة بنجاح في واجهة الهواء والماء، فمن المستحسن بشدة أن يتم إعداد الدهون طازجة في يوم التجربة، لأن أكسدة سلسلة أسيل الدهون يمكن أن يؤدي إلى اضطراب التعبئة في …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم إعداد هذه المخطوطة جزئيا من قبل مكتب أبحاث الجيش الأمريكي (W911NF2010321) وصناديق بدء تشغيل جامعة ولاية أريزونا إلى P.-L.C.
Materials
| 14:0 PC (DMPC) | Avanti Lipids | 850345 | 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 1 x 25 mg, 10 mg/mL, 2.5 mL |
| Bulb for small pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | |
| Desiccator vacuum | Southern Labware | 55207 | |
| EM grids | Electron Microscopy Sciences | CF413-50 | CF-1.2/1.3-4C 1.2 µm hole, 1.3 µm space |
| Filter paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-090 | Diameter 90 mm |
| Glass Pasteur pipets | Fisher Scientific | 13-678-20A | |
| Hamilton syringe (25 µL) | Hamilton Company | 80465 | |
| Hamilton syringe (250 µL) | Hamilton Company | 81165 | |
| Hamilton syringe (5 µL) | Hamilton Company | 87930 | |
| Hamilton syringe (500 µL) | Hamilton Company | 203080 | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | M1775-1GA | |
| Petri dish | VWR | 25384-342 | 100 mm × 15 mm |
| Teflon block | Grainger | 55UK05 | 60 µL wells with side injection ports, manually made |
| Tweezers | Electron Microscopy Sciences | 78325 | Various styles |
| Ultra-pure water | |||
| Ultrasonic cleaner | VWR | 97043-996 |
References
- Raunser, S., Walz, T. Electron crystallography as a technique to study the structure on membrane proteins in a lipidic environment. Annual Review of Biophysics. 38 (1), 89-105 (2009).
- Avila-Sakar, A. J., Chiu, W. Visualization of beta-sheets and side-chain clusters in two-dimensional periodic arrays of streptavidin on phospholipid monolayers by electron crystallography. Biophysical Journal. 70 (1), 57-68 (1996).
- Braun, T., Engel, A. Two-dimensional electron crystallography. Nature Encyclopedia of Life Sciences. , (2004).
- Wang, H. -. W., Wang, J. -. W. How cryo-electron microscopy and X-ray crystallography complement each other. Protein Science: a publication of the Protein Society. 26 (1), 32-39 (2017).
- Williams, D. B., Carter, C. B. . Transmission electron microscopy. , (2016).
- Abeyrathne, P. D., et al. 1.15 Analysis of 2-D Crystals of Membrane Proteins by Electron Microscopy. Comprehensive Biophysics. , 277-310 (2012).
- Muller, M. P., et al. Characterization of Lipid-Protein Interactions and Lipid-Mediated Modulation of Membrane Protein Function through Molecular Simulation. Chemical Reviews. 119 (9), 6086-6161 (2019).
- Martínez-Ballesta, M. D. C., Carvajal, M. Mutual Interactions between Aquaporins and Membrane Components. Frontiers in Plant Science. 7, 1322 (2016).
- Hite, R. K., Chiu, P. -. L., Schuller, J. M., Walz, T. Effect of lipid head groups on double-layered two-dimensional crystals formed by aquaporin-0. PloS One. 10 (1), 0117371 (2015).
- Murata, K., et al. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1. Nature. 407 (6804), 599-605 (2000).
- Schenk, A. D., et al. The 4.5 A structure of human AQP2. Journal of Molecular Biology. 350 (2), 278-289 (2005).
- Gonen, T., et al. Lipid-protein interactions in double-layered two-dimensional AQP0 crystals. Nature. 438 (7068), 633-638 (2005).
- Hiroaki, Y., et al. Implications of the aquaporin-4 structure on array formation and cell adhesion. Journal of Molecular Biology. 355 (4), 628-639 (2006).
- Gonen, T., Sliz, P., Kistler, J., Cheng, Y., Walz, T. Aquaporin-0 membrane junctions reveal the structure of a closed water pore. Nature. 429 (6988), 193-197 (2004).
- Chiu, P. -. L., et al. The structure of the prokaryotic cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1 at 16 A resolution. Structure. 15 (9), 1053-1064 (2007).
- Kowal, J., et al. Ligand-induced structural changes in the cyclic nucleotide-modulated potassium channel MloK1. Nature Communications. 5, 3106 (2014).
- Walz, T., Grigorieff, N. Electron Crystallography of Two-Dimensional Crystals of Membrane Proteins. Journal of Structural Biology. 121 (2), 142-161 (1998).
- Yeager, M., Dryden, K. A., Ganser-Pornillos, B. K. Lipid monolayer and sparse matrix screening for growing two-dimensional crystals for electron crystallography: methods and examples. Methods in Molecular Biology. 955, 527-537 (2013).
- Pal, S. Chapter 6 – Structure analysis and visualization. Fundamentals of Molecular Structural Biology. , 119-147 (2020).
- Frey, W., et al. Two-dimensional protein crystallization via metal-ion coordination by naturally occurring surface histidines. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (10), 4937-4941 (1996).
- Kubalek, E. W., Le Grice, S. F., Brown, P. O. Two-dimensional crystallization of histidine-tagged, HIV-1 reverse transcriptase promoted by a novel nickel-chelating lipid. Journal of Structural Biology. 113 (2), 117-123 (1994).
- Vénien-Bryan, C., et al. Structural study of the response regulator HupR from Rhodobacter capsulatus. Electron microscopy of two-dimensional crystals on a nickel-chelating lipid. Journal of Molecular Biology. 274 (5), 687-692 (1997).
- Merritt, E. A., Sarfaty, S., vanden Akker, F., L’Hoir, C., Martial, J. A., Hol, W. G. Crystal structure of cholera toxin B-pentamer bound to receptor GM1 pentasaccharide. Protein Science: a publication of the Protein Society. 3 (2), 166-175 (1994).
- Mosser, G., Mallouh, V., Brisson, A. A 9 A two-dimensional projected structure of cholera toxin B-subunit-GM1 complexes determined by electron crystallography. Journal of Molecular Biology. 226 (1), 23-28 (1992).
- Edwards, A. M., Darst, S. A., Hemming, S. A., Li, Y., Kornberg, R. D. Epitaxial growth of protein crystals on lipid layers. Nature Structural Biology. 1 (3), 195-197 (1994).
- Olofsson, A., Mallouh, V., Brisson, A. Two-dimensional structure of membrane-bound annexin V at 8 A resolution. Journal of Structural Biology. 113 (3), 199-205 (1994).
- Ribi, H. O., Ludwig, D. S., Mercer, K. L., Schoolnik, G. K., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of cholera toxin penetrating a lipid membrane. Science. 239 (4845), 1272-1276 (1988).
- Celia, H., et al. Three-dimensional model of Escherichia coli gyrase B subunit crystallized in two-dimensions on novobiocin-linked phospholipid films. Journal of Molecular Biology. 236 (2), 618-628 (1994).
- Darst, S. A., Kubalek, E. W., Kornberg, R. D. Three-dimensional structure of Escherichia coli RNA polymerase holoenzyme determined by electron crystallography. Nature. 340 (6236), 730-732 (1989).
- Schultz, P., et al. Structural study of the yeast RNA polymerase A. Electron microscopy of lipid-bound molecules and two-dimensional crystals. Journal of Molecular Biology. 216 (2), 353-362 (1990).
- Dryden, K. A., Crowley, C. S., Tanaka, S., Yeates, T. O., Yeager, M. Two-dimensional crystals of carboxysome shell proteins recapitulate the hexagonal packing of three-dimensional crystals. Protein Science: a publication of the Protein Society. 18 (12), 2629-2635 (2009).
- Barklis, E., McDermott, J., Wilkens, S., Fuller, S., Thompson, D. Organization of HIV-1 capsid proteins on a lipid monolayer. The Journal of BIOLOGICAL CHemistry. 273 (13), 7177-7180 (1998).
- Barklis, E., et al. Structural analysis of membrane-bound retrovirus capsid proteins. The EMBO Journal. 16 (6), 1199-1213 (1997).
- Kelly, D. F., Dukovski, D., Walz, T. Monolayer purification: a rapid method for isolating protein complexes for single-particle electron microscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (12), 4703-4708 (2008).
- Reis, A., Rudnitskaya, A., Blackburn, G. J., Mohd Fauzi, N., Pitt, A. R., Spickett, C. M. A comparison of five lipid extraction solvent systems for lipidomic studies of human LDL. Journal of Lipid Research. 54 (7), 1812-1824 (2013).
- Ueda, E. K. M., Gout, P. W., Morganti, L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding. Journal of Chromatography. A. 988 (1), 1-23 (2003).
- Dietrich, J., nien-Bryan, C. . Strategies for Two-dimensional Crystallization of Proteins Using Lipid Monolayers. , (2005).
- Kuang, Q., Purhonen, P., Hebert, H. Two-Dimensional Crystallization Procedure, from Protein Expression to Sample Preparation. BioMed Research International. 2015, 693869 (2015).
- De Zorzi, R., Nicholson, W. V., Guigner, J. -. M., Erne-Brand, F., Vénien-Bryan, C. Growth of large and highly ordered 2D crystals of a K+ channel, structural role of lipidic environment. Biophysical Journal. 105 (2), 398-408 (2013).
- Johnson, M. C., Schmidt-Krey, I. Two-dimensional crystallization by dialysis for structural studies of membrane proteins by the cryo-EM method electron crystallography. Methods in Cell Biology. 113, 325-337 (2013).
- Rémigy, H. -. W., Caujolle-Bert, D., Suda, K., Schenk, A., Chami, M., Engel, A. Membrane protein reconstitution and crystallization by controlled dilution. FEBS Letters. 555 (1), 160-169 (2003).
- Braun, T., Kaufmann, T. C., Rémigy, H., Engel, A. Two-dimensional Crystallization of Membrane Proteins. Encyclopedic Reference of Genomics and Proteomics in Molecular Medicine. , 1936-1942 (2006).
- Lebeau, L., Vénien-Bryan, C. Monolayer two-dimensional crystallization of membrane proteins. Methods in Molecular Biology. 955, 59-71 (2013).
- Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera. Biochimica et Biophysica Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).
- Lebeau, L., et al. Two-dimensional crystallization of a membrane protein on a detergent-resistant lipid monolayer. Journal of Molecular Biology. 308 (4), 639-647 (2001).
