Murine Hind-limb Damarlarının Bilgisayarlı Tomografi Tabanlı Üç Boyutlu Görselleştirilmesi için Örnek Hazırlık
Summary
Burada, mikro-X-ışını bilgisayarlı tomografi kullanarak murine arka eks uzuv damarları için bir görselleştirme ve niceleme yöntemini açıklıyoruz.
Abstract
Kan damarları ağaç benzeri yapılara sahip karmaşık ağlardır ve damar ağları hem dolaşımı korumak hem de organ fonksiyonunu korumak için gereklidir. Bu nedenle kan damarı oluşum mekanizmasının netleştirilmesi, gelişimsel süreçleri ve patolojik mekanizmaları aydınlatmak için son derece yararlıdır. Murine arka ekstremite damarları genellikle fizyolojik ve patolojik anjiogenez için bir model olarak kullanılır. Değerlendirme esas olarak doku bölümleri kullanılarak iki boyutlu bir yöntemle gerçekleştirilir. Bununla birlikte, üç boyutlu (3D) vasküler morfolojiyi değerlendirme yöntemleri özellikle sınırlıdır. Bu makalede, bilgisayarlı tomografi (BT) kullanılarak murine arka uzuvların görselleştirilmesi için bir yöntem tanıtılmıştır. Radyasyon-opak reçine, alçalan aorttan enjekte edilir ve tüm damarlar boya ile doldurulur. Boya enjeksiyonunun süresinin ayarlanmasıyla arteriyel spesifik dolgu da mümkündür ve herhangi bir mikro-X-ışını CT cihazı ile numuneler alınabilir. Bu kontrast yöntemi, alt ekstremitelerdeki murin kan damarlarının 3D değerlendirilmesi için temel bir teknik sağlar. Ayrıca, bu yöntem diyaframın altındaki tüm kan damarlarını görselleştirmek ve karın organlarındaki kan damarlarını değerlendirmek için kullanılabilir.
Introduction
Kan damarları ağaç benzeri yapılara sahip karmaşık ağlardır. Anjiogenez ve yeni vasküler oluşum organ homeostazının sürdürülmesinde önemli roller oynar1. Anjiogenez iskemik ve kötü huylu hastalıkların tedavisi için düzenlenir2. Bu nedenle anjiogenezin altında kalan mekanizmaları anlamak esastır. Murine arka eks uzuv damarları genellikle damar araştırmaları için yararlı bir model olarak kullanılır3; iliak veya femoral arterin ipsilateral ligasyonu, fizyolojik ve patolojik anjiogenezde anjiogenez ve vasküler remodelasyonu değerlendirmek için kullanılan bilinen bir arka ekstremite iskemi modelidir4. Bununla birlikte, anjiogenezin değerlendirilmesi esas olarak kesit boyama ile gerçekleştirilir ve 3D vasküler morfolojiyi değerlendirme yöntemleri özellikle sınırlıdır.
Kesit boyama ile karşılaştırıldığında, CT 3D görselleştirme sağlar. Son zamanlarda, Weyers ve arkadaşları, murine yetişkin koroner dolaşım sisteminin görselleştirilmesini sağlayan BT görüntüleme için uygun sofistike bir protokol bildirmektedir5. Alt ekstremite kan damarlarının BT görüntülemesine uygun bir örnek hazırlama yöntemi oluşturmak için yöntemlerini değiştirdik6. Burada, alçalan aorttan radyasyon-opak bir reçine enjekte edilir ve alt ekstremitelerdeki damarlar boya ile doldurulur. Boya enjeksiyonunun zamanı ayarlanarak arteriyel spesifik dolgu da mümkündür ve herhangi bir mikro-X-ışını bilgisayarlı tomografi cihazı ile numuneler alınabilir. Bu kontrast yöntemi diyaframın altındaki ve karın organlarında ve alt ekstremitelerde murin kan damarlarının 3D değerlendirilmesi için temel bir teknik sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu rapor, alt vücuttaki kan damarlarını görselleştirmek için sofistike bir yöntem sunar. Bu süreçte birkaç kritik adım vardır: birincisi kontrast ortamının enjeksiyonundan önce preperfüzyondur. Yeterli kan çıkarılmazsa, kontrast sistemi doldurmaz. Ek olarak, hava kabarcıklarının dahil edilmesi kontrastın doldurulması rahatsız eder; böylece devredeki hava tamamen çıkarılmalıdır. Ayrıca, kontrast ortamı enjeksiyondan hemen sonra katılaşmadığı için, numune aşırı hareket ettirilmemelidir.
Bu yöntem, kollateral dolaşım gibi kan damarlarının ve dolaşımın artan oluşumunu değerlendirmek için yararlıdır. Tersine, bir sınırlama olarak, dar kan damarlarını değerlendirmek zordur, çünkü darlık ve kontrast ortamda yapay bir azalma arasında ayrım yapmak zordur. Ek olarak, kan ve kemik ayrımı zor olduğu için kemiklerdeki kan damarlarını değerlendirmek zordur.
3D görselleştirme için alternatif bir yöntem immünostainingdir. Doku temizleme tekniği kullanılarak, 3D görüntüleme için çeşitli yöntemler mevcuttur7. İmmünostaining, antikorlar kullanılarak belirli proteinlerin lekelenerek boyanmalarına izin verdiği için avantajlıdır. Yeni bir rapor immünostaininge dayalı tüm vücut görüntülemeye meydan okuyor8; ancak BT tabanlı görüntüleme herhangi bir doku temizleme ön işlem gerektirmez.
Bu yöntem, karın organları da dahil olmak üzere diyaframın altındaki tüm damarların görselleştirilmesini sağlar. Karın organlarında anjiogenez homeostazın korunması ve hastalıkların gelişmesi üzerinde güçlü bir etkiye sahiptir9,10. Bu protokol alt ekstremite damarlarının değerlendirilmesi için optimize edildiği için organa özgü astarlama, iltihaplanma veya tümörler gibi herhangi bir faktörle ilişkili anjiogenezin görselleştirilmesini sağlayacaktır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hayvan deneylerindeki mükemmel teknik destek için Yasuyo Kimura, Megumi Nagahiro ve Saeko Tokunaga’ya teşekkür ederiz.
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al. Angiogenesis in liver disease. Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
