Пробоподготовка для трехмерной визуализации сосудов задних конечностей на основе компьютерной томографии
Summary
Здесь мы описываем метод визуализации и количественной оценки сосудов задних конечностей мышей с использованием микро-рентгеновской компьютерной томографии.
Abstract
Кровеносные сосуды представляют собой сложные сети с древовидными структурами, а сосудистые сети необходимы для поддержания как кровообращения, так и поддержания функции органа. Поэтому выяснение механизма образования кровеносных сосудов чрезвычайно полезно для выяснения процессов развития и патологических механизмов. Мышиные сосуды задних конечностей часто используются в качестве модели физиологического и патологического ангиогенеза. Оценка в основном выполняется двумерным методом с использованием тканевых срезов. Однако методы оценки трехмерной (3D) морфологии сосудов особенно ограничены. В данной работе представлен метод визуализации задних конечностей мышей с помощью компьютерной томографии (КТ). Радиационно-непрозрачная смола вводится через нисходящую аорту, а целые сосуды заполняются красителем. Регулируя время инъекции красителя, также возможно артериально-специфическое заполнение, и образцы могут быть получены с помощью любого микро-рентгеновского КТ-устройства. Этот контрастный метод обеспечивает базовую технику для 3D-оценки мышиных кровеносных сосудов в нижних конечностях. Кроме того, этот метод может быть использован для визуализации всех кровеносных сосудов ниже диафрагмы и оценки кровеносных сосудов в органах брюшной полости.
Introduction
Кровеносные сосуды представляют собой сложные сети с древовидными структурами. Ангиогенез и новое сосудистое образование играют важную роль в поддержании гомеостаза органа1. Ангиогенез регулируется для лечения ишемических и злокачественных заболеваний2. Поэтому важно понять основные механизмы ангиогенеза. Мышиные сосуды задних конечностей часто используются в качестве полезной модели для сосудистых исследований3; ипсилатеральная перевязка подвздошной или бедренной артерии является известной моделью ишемии задних конечностей, используемой для оценки ангиогенеза и ремоделирования сосудов в физиологическом и патологическом ангиогенезе4. Однако оценка ангиогенеза в основном выполняется окрашиванием сечения, а методы оценки 3D-морфологии сосудов особенно ограничены.
По сравнению с окрашиванием секций, КТ обеспечивает 3D-визуализацию. Недавно Weyers et al. сообщили о сложном протоколе, подходящем для КТ-визуализации, позволяющем визуализировать систему коронарного кровообращения у взрослых мышей5. Мы модифицировали их метод, чтобы создать метод пробоподготовки, подходящий для компьютерной томографии кровеносных сосудов нижних конечностей6. Здесь через нисходящую аорту вводится радиационно-непрозрачная смола, а сосуды в нижних конечностях заполняются красителем. Регулируя время инъекции красителя, также возможно артериально-специфическое заполнение, и образцы могут быть получены с помощью любого микро-рентгеновского компьютерного томографического устройства. Этот контрастный метод обеспечивает базовую технику для 3D-оценки мышиных кровеносных сосудов ниже диафрагмы и в органах брюшной полости и нижних конечностях.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом отчете представлен сложный метод визуализации кровеносных сосудов в нижней части тела. В этом процессе есть несколько критических этапов: первый – это преперфузия перед инъекцией контрастного вещества. Если не удалить достаточное количество крови, контраст не заполнит систему. Кроме того, включение пузырьков воздуха нарушает наполнение контраста; таким образом, воздух в цепи должен быть полностью удален. Более того, поскольку контрастное вещество не затвердевает сразу после инъекции, образец не следует чрезмерно перемещать.
Этот метод полезен для оценки повышенного образования кровеносных сосудов и кровообращения, таких как коллатеральное кровообращение. И наоборот, в качестве ограничения трудно оценить суженные кровеносные сосуды, так как отличить стеноз от искусственного уменьшения контрастного вещества сложно. Кроме того, трудно оценить кровеносные сосуды в костях, так как разделение крови и кости затруднено.
Альтернативным методом 3D-визуализации является иммуноокрашивание. Используя технику очистки тканей, для 3D-визуализации доступно несколько методов7. Иммуноокрашивание является преимуществом, поскольку оно позволяет окрашивать специфические белки с использованием антител. В недавнем докладе ставится задача по визуализации всего тела на основе иммуноокрашивания8; однако визуализация на основе КТ не требует предварительной обработки тканей.
Этот метод позволяет визуализировать все сосуды ниже диафрагмы, включая органы брюшной полости. Ангиогенез в органах брюшной полости оказывает сильное влияние на поддержание гомеостаза и развитие заболеваний9,10. Поскольку этот протокол был оптимизирован для оценки сосудов нижних конечностей, орган-специфическое праймирование позволило бы визуализировать ангиогенез, связанный с любым фактором, таким как воспаление или опухоли.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Ясуё Кимуру, Мэгуми Нагахиро и Саэко Токунагу за отличную техническую поддержку в экспериментах на животных.
Materials
| 1 mL syringe | TERUMO | SS-01T | |
| 10% Formalin Solution | Fujifilm-Wako | 068-03841 | |
| 10x phosphate-buffered saline (-) (PBS) | Fujifilm-Wako | 163-25265 | Prepare 1x PBS |
| 22 G catheter (22 G S5 x 1" V(F)) | MEDIKIT | HP2140 | Only catheter is used. |
| 23 G needle | TERUMO | NN-2325R | Use as a pin |
| 4% paraformaldehyde in PBS | Fujifilm-Wako | 163-20145 | |
| 5 mL syringe | |||
| 5-0 Suture with needle | Alfresa Pharma Corporation | ER1205SB45 | |
| Adenosine | Sigma-aldrich | A9251-5G | For vasodilating solution |
| Dumont #55 Forceps | FST | No.11255-20 | |
| Extension tube | TOP | X2-FL50 | |
| Falcon 50 mL tube | CORNING | 352098 | |
| Graefe Forceps | FST | No.11051-10 | |
| Heparin Sodium 5,000 units/5 mL | Mochida Co. Ltd. | 224122458 | |
| Isoflurane | Fujifilm-Wako | 099-06571 | |
| Microfil Injection Compounds | Flow Tech Inc. | MV-117 | Mix liquid MV-Compound (stain) and MV-Diluent 1: 1 |
| Papaverine hydrochloride | Fujifilm | 164-18002 | For vasodilating solution |
| Small Animal Anesthetizer | Muromachi Kikai Co. Ltd. | MK-A100ecoW-ST | |
| Spring Scissors – Angled to Side | FST | No.15006-09 | |
| Surgical Scissors – Sharp-Blunt | FST | No.14001-12 | |
| three-way cock | TERUMO | TS-TR1K | |
| Transfer pipette | SAMCO SCIENTIFIC | SM262-1S | Use for mixing contrast medium |
| X-ray CT scanner | Toshiba IT & Control Systems Corporation | TOSHIBA TOSCANNER 32300 FPD |
References
- Folkman, J. Angiogenesis. Annual Review of Medicine. 57, 1-18 (2006).
- Folkman, J. Angiogenesis in cancer, vascular, rheumatoid and other disease. Nature Medicine. 1 (1), 27-31 (1995).
- Kochi, T., et al. Characterization of the arterial anatomy of the murine hindlimb: functional role in the design and understanding of ischemia models. PLoS One. 8 (12), 84047 (2013).
- Limbourg, A., et al. Evaluation of postnatal arteriogenesis and angiogenesis in a mouse model of hind-limb ischemia. Nature Protocols. 4 (12), 1737-1746 (2009).
- Weyers, J. J., Carlson, D. D., Murry, C. E., Schwartz, S. M., Mahoney, W. M. Retrograde perfusion and filling of mouse coronary vasculature as preparation for micro computed tomography imaging. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (60), e3740 (2012).
- Arima, Y., et al. Evaluation of collateral source characteristics with 3-dimensional analysis using micro-X-ray computed tomography. Journal of the American Heart Association. 7 (6), 007800 (2018).
- Tian, T., Yang, Z., Li, X. Tissue clearing technique: Recent progress and biomedical applications. Journal of Anatomy. 238 (2), 489-507 (2021).
- Susaki, E. A., et al. Advanced CUBIC protocols for whole-brain and whole-body clearing and imaging. Nature Protocols. 10 (11), 1709-1727 (2015).
- Fernandez, M., et al. Angiogenesis in liver disease. Journal of Hepatology. 50 (3), 604-620 (2009).
- Li, S., et al. Angiogenesis in pancreatic cancer: current research status and clinical implications. Angiogenesis. 22 (1), 15-36 (2019).
