Murine 힌드사지 선박의 계산 단층 촬영 기반 3차원 시각화를 위한 샘플 준비

모든 절차는 구마모토 대학 동물 관리 지침에 따라 수행되었다 (승인 참조 없음. M30-040/A2020-105, 실험실 동물의 치료 및 사용에 대 한 건강 가이드의 미국 국립 학회에 따라 (간행물 번호 85-23, 개정 2011). 1. 준비 관혈 장치 및 혈관 확장제 버퍼(4 mg/L 파파베린 염산염, 4 g/L; 아데노신, 1 g/L; 헤파린, 인산완충식식(PBS)의 U/mL 1)을 준비한다.참고: 역류 장치 및 혈관 확장제 시약은 Weyers 외.5에 의해 보고된 것과 동일합니다. 22 G 카테터, 2mL 확장 튜브 및 3 방향 스톱콕 (그림 1A)을 연결합니다.참고: 동물의 크기에 따라 게이지를 조정합니다. 성인 C57BL/6 마우스의 경우 22G가 최적입니다. 혈관 확장제 버퍼(도 1A)로 압력 관류 장치를 채웁니다.참고: 콘트라스트 배지의 충전을 방지하기 위해 거품의 형성을 피하십시오. 2. 관류 PBS에 U/g 헤파린 1개를 주입하여 수술 30분 전에 복막 내 구멍에 넣습니다. 완전히 이소플루란으로 마우스를 마취하고 자궁 경부 탈구로 안락사. 참수 후 흉골에 중간 선 절개를하고 핀으로 열린 흉부를 수정합니다.참고: 대비의 누출을 피하려면 다이어프램을 손상시키지 마십시오. 오름차순 대자를 잘라 마음을 제거합니다. 폐를 제거하고 내림차순 대어를 노출합니다.참고 : 내림차순 대어를 다치게하지 마십시오. 내림차순 대동맥을 대각선으로 잘라 단면을 노출시니다(도 1B).참고 : 대마를 벗기지 마십시오. 대각선 단면도는 카테터 삽입에 더 좋습니다. 혈관 확장 버퍼를 실행하는 동안 내림차순 대어에 22 G 카테터를 삽입합니다.참고: 혈관 확장 버퍼를 실행하는 동안 카테터를 삽입하여 공기 오염을 방지합니다. 카테터의 루트를 고정합니다(그림 1C). 역류로 인한 누출을 방지하기 위해 매듭을 만듭니다. 13~15kPa 사이의 고정 압력에서 3분 동안 온난한 혈관 확장 용액(파파베린 염산염, 4g/L; 아데노신, 1g/L; 헤파린 1개 U/mL)을 3분 동안 퍼퓨즈합니다. 3 분 동안 (PBS)에서 4 % 파라 포름 알데히드의 용액을 Perfuse.참고: 고정의 성공은 발의 움직임에 의해 확인할 수 있습니다(도 1D). 관류 직전에 대비 배지를 준비합니다.참고: 샘플에 따라 희석속도를 조정하는 행위 성인 마우스의 경우 얼룩과 희석제를 1:1의 비율로 섞습니다. 관류를 중지하고 희석 된 콘트라스트 배지의 2 mL로 연장 튜브를 채웁니다 (도 1E).참고: 대조 매체는 혈관에 손상을 피하기 위해 천천히 주입되어야 합니다. 13~15kPa 사이의 고정 압력으로 대비 배지를 퍼퓨즈한다. 동맥을 시각화하려면 발톱을 확인하여 대조 매체가 동맥에 도달했는지 확인합니다(도 1F). 모든 혈관을 시각화하려면 다이어프램의 열등한 베나 카바를 확인하여 콘트라스트 매체의 완전한 순환을 확인하십시오.참고: 처음에는 콘트라스트에 혈관 확장 솔루션이 포함되어 있습니다. 따라서 적절한 순환이 필수적입니다. 3방향 스톱콕을 닫고 튜브를 제거합니다(그림 1G).참고: 3방향 스톱콕이 닫히지 않으면 대비가 뒤로 흐르게 됩니다. 샘플을 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다. 피부를 제거하고 10 % 포름 알데히드 용액으로 고정하십시오. 3. 시각화 참고: 시각화 프로토콜은 CT 스캐너에 따라 다릅니다. 이 프로토콜에는 마이크로포커스 X-ray CT 스캐너가 사용되었습니다. 각 CT 스캐너에 따라 이미징 방법을 최적화해야 합니다. PBS를 포함하는 50 mL 튜브에서 샘플을 수정합니다. 샘플 튜브를 테이블에 놓습니다. 50kV의 전압과 600 μA의 전류로 샘플을 스캔하여 75.2mm의 초점-센터 거리를 보장합니다.참고: 복셀 1의 치수는 이 설정에서 28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μm x 28.7 μm이었다. 생물학적 이미지 분석을 위한 오픈 소스 플랫폼인 피지(Fiji)로 획득한 이미지 데이터를 로드합니다. 위트락혈증 근육을 사용하여 근육 복셀 값을 결정합니다. 직사각형 도구를 사용하여 위트로테뉴근육을 선택합니다. 히스토그램의 평균 및 표준 편차(SD)를 확인합니다(| 분석 히스토그램). 위트락혈증 근육의 평균 + 2SD로 근육 복셀 밀도를 정의합니다. 근육 복셀 밀도를 낮은 임계값 수준으로 설정합니다(이미지 | 조정할 | | 임계값 | | 설정 낮은 임계값 수준).참고: 혈관 영역과 뼈 영역은 임계값을 설정한 후에도 바이나드된 데이터에 남아 있습니다.