Summary
Plaquing er en rutinemæssig metode, der bruges til at kvantificere levende vira i en befolkning. Selvom plaquing ofte undervises i forskellige mikrobiologiske læseplaner med bakterier og bakteriofager, er plaquing af pattedyrvirus mere kompleks og tidskrævende. Denne protokol beskriver de procedurer, der fungerer pålideligt til regelmæssigt arbejde med herpes simplex-vira.
Abstract
Der er adskillige offentliggjorte protokoller til plaquing af vira, herunder referencer inden for primær litteratur til metodologi. Imidlertid kan plaquing vira være vanskelige at udføre, hvilket kræver fokus på dets specifikationer og forfining. Det er en utrolig udfordrende metode for nye studerende at mestre, hovedsageligt fordi det kræver omhyggelig opmærksomhed på de mest minutiøse detaljer. Denne demonstration af plaquing herpes simplex vira bør hjælpe dem, der har kæmpet med at visualisere metoden, især dens nuancer, gennem årene. Selv om dette manuskript er baseret på de samme principper for standardplaquing-metoden, adskiller det sig ved, at det indeholder en detaljeret beskrivelse af (1) hvordan man bedst håndterer værtsceller for at undgå forstyrrelser under processen, (2) et mere nyttigt viskøst medium end agarose for at begrænse diffusionen af virioner og (3) en simpel fikserings- og farvningsprocedure, der giver pålideligt reproducerbare resultater. Desuden hjælper den ledsagende video med at demonstrere de finere sondringer i processen, som ofte savnes, når man instruerer andre om at udføre plaque-assays.
Introduction
Begyndelsen på virusplaque-assays går tilbage til de første opdagelser af vira i 1890’erne1. Tobaksmosaikvirus blev først isoleret og videregivet tobaksblade, hvor individuelle infektionspletter kunne genkendes og kvantificeres som hidrørende fra en enkelt, levende virusenhed2, der senere blev identificeret som en virion2. Senere skelsættende undersøgelser med bakterier og bakteriofager perfektionerede de teknikker, der blev brugt til at plaque disse vira, herunder bakterier i midten af vækstfasen, seriel fortynding af bakteriofagprøver og topagar med efterfølgende visualisering af bogstavelige huller (navngivne plaques) i bakterieplænen3.
Plaquing af dyrevirus forsinkede den spændende forskning, der blev udført med bakteriofager, hovedsageligt fordi de metoder, der kræves til dyrkning af pattedyrceller i kultur, først blev udviklet i 1940’erne4. Fremkomsten af voksende murineceller i fravær af hele værtsorganismen4 skabte imidlertid en ny æra i evnen til at dyrke og tælle vira. Et sådant arbejde blev udvidet til formering og kvantation af Western Equine Encephalomyelitis virus i kyllingeceller og poliovirus i humane celler5,6. Efterhånden som området for dyrkelige pattedyrceller udvidede sig, gav de forskellige værtscellers væld af forskellige virusinfektioner verden et overflødighedshorn af muligheder for at studere alle mulige vira7. Dette omfattede udbredelse og kvantificering af humane herpesvirus, især herpes simplex virus-1 (HSV-1) og -2 (HSV-2), som forårsager mucokutane læsioner8. Det er vigtigt, at alle plaque-assays er afhængige af eksistensen af levende virioner, som kan komme ind i værtsceller på en receptormedieret måde i en prøve9. Uanset den allestedsnærværende og mangfoldighed af publikationer om udførelse af plaque assays5,10,11,12,13,14,15,16 er disse metoder til HSV-1/-2 en blanding af både kunst og videnskab; man kan ikke udføre analysen uden behørig opmærksomhed på alle detaljer i protokollen, og man kan heller ikke udføre et vellykket assay uden et krtitisk øje for subtilitet i processen. Dette manuskript skildrer en af de mest konsekvent reproducerbare metoder til HSV-1/-2 plaque assays, med præcise detaljer mod assayets kunst, der sjældent diskuteres.
Denne nuværende protokol opnår levende plakdannende enheder (PFU) tæller pålideligt for HSV-1 og -2. De bedste resultater opnås ved anvendelse af Vero-celler (transformerede afrikanske grønne abenyrepitelceller) ved lav passage (under passage nummer 155) og rutinemæssigt dyrket i alfa-MEM17 suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS), L-alanyl-L-glutamin og en antibiotikum/antimykotisk blanding18. Vero-celler formeres normalt i dette medium to til tre gange om ugen ved en 1/5 fortynding hver gang.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens plaque-assays er næsten lige så gamle som selve pattedyrcellekulturen, ser det ud til, at hvert laboratorium har sit eget sæt protokoller til at udføre dette grundlæggende assay5,6,10,11,12,13,14,15,16,20 </…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker utallige studerende i vores laboratorier (PJD og BJM), der har arbejdet sammen med os gennem årene med at forfine disse metoder. En særlig tak til Stan Person, under hvis vejledning denne metode først blev udviklet. Dette arbejde blev delvist støttet af Towson University Fisher College of Science and Math Undergraduate Research Support Fund og NIGMS Bridges til Baccalaureate grant 5R25GM058264. Dette indhold er udelukkende forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter fra National Institutes of Health’s National Institute of General Medical Sciences.
Materials
| 12-well plates | Corning | 3512 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Alpha-MEM | Lonza | 12169F | |
| Antibiotic/antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| Crystal violet | Alfa Aesar | B2193214 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco's PBS (no Mg++ or Ca++) | Gibco | 14190144 | |
| Fetal calf serum | Millipore-Sigma | TMS-013-B | |
| L-alanyl-L-glutamine (Glutamax) | Gibco | GS07F161BA | |
| Hemacytometer | Thermo Fisher | 02-671-54 | |
| Methylcellulose | Millipore-Sigma | 27-441-0 | |
| Quaternary agent (Lysol I.C.) | Thermo Fisher | NC9645698 | |
| Trypan Blue | Corning | 25900CI | |
| Trypsin | Cytiva | SH30042.01 | |
| Vero cells | ATCC | CCL-81 |
References
- Dimmock, N., Easton, A., Leppard, K. . Introduction to Moden Virology. 6th end. , (2007).
- Mahy, B., Collier, L. . Topley and Wilson’s Microbiology and Microbial Infections. 9th edn. 1, (1998).
- Anderson, B., et al. Enumeration of bacteriophage particles: Comparative analysis of the traditional plaque assay and real-time QPCR- and nanosight-based assays. Bacteriophage. 1 (2), 86-93 (2011).
- Earle, W. R., et al. Production of malignancy in vitro; IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells. Journal of the National Cancer Institute. 4 (2), 165-212 (1943).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18, 273-279 (1953).
- Enders, J. F., Weller, T. H., Robbins, F. C. Cultivation of the lansing strain of poliomyelitis virus in cultures of various human embryonic tissues. Science. 109 (2822), 85-87 (1949).
- Enders, J. F. Cytopathology of virus infections: particular reference to tissue culture studies. Annual Review of Microbiology. 8, 473-502 (1954).
- Roizman, B., Knipe, D. M., Whitley, R. J., Knipe, D. M., et al. . Fields Virology. 1, 1823-1897 (2013).
- Madavaraju, K., Koganti, R., Volety, I., Yadavalli, T., Shukla, D. Herpes simplex virus cell entry mechanisms: An update. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 617578 (2020).
- Cooper, P. D. The plaque assay of animal viruses. Advances in Virus Research. 8, 319-378 (1961).
- Farnham, A. E. The formation of microscopic plaques by herpes simplex virus in HeLa cells. Virology. 6 (2), 317-327 (1958).
- Garabedian, G. A., Scott, L. V. Plaque assay for herpes simplex virus in L-929 (Earle) mouse fibroblasts. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 126 (2), 568-571 (1967).
- Lancz, G. J. Herpes simplex viruses types 1 and 2. Type and strain specific characteristics affecting virus plaque formation. Arch Gesamte Virusforsch. 46 (1-2), 36-43 (1974).
- Muratore, O., Tonoli, E. L., Pesce Schito, A. A short-term plaque assay for antiviral drug research on herpes simplex virus type 2. New Microbiologica. 19 (3), 257-261 (1996).
- Sato, S., Kaneki, H., Shirai, J., Takahashi, K., Kawana, R. Differentiation of herpes simplex virus types 1 and 2 by plaque appearances on semicontinuous rabbit lens epithelial cells in the clinical laboratory. Kansenshogaku Zasshi. 67 (6), 561-573 (1993).
- Yazaki, S., Taniguchi, S., Yoshino, K. Improvement of the plaque assay of herpes simplex virus in HeLa cells. Japanese Jouranl of Microbiology. 10 (3), 133-139 (1966).
- Stanners, C. P., Eliceiri, G. L., Green, H. Two types of ribosome in mouse-hamster hybrid cells. Nature New Biology. 230 (10), 52-54 (1971).
- Giannasca, N. J., Suon, J. S., Evans, A. C., Margulies, B. J. Matrix-based controlled release delivery of acyclovir from poly-(ethylene co-vinyl acetate) rings. Journal of Drug Delivery Science and Technology. 55, 101391 (2020).
- Freshney, R. I. . Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique and Specialized Applications. 7th edn. , (2016).
- Dulbecco, R. Production of plaques in monolayer tissue cultures by single particles of an animal virus. Proceedings of the National Academy of Science, USA. 38 (8), 747-752 (1952).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments. (93), e52065 (2014).
- Matrosovich, M., Matrosovich, T., Garten, W., Klenk, H. D. New low-viscosity overlay medium for viral plaque assays. Virology Journal. 3, 63 (2006).
- Culley, S., Towers, G. J., Selwood, D. L., Henriques, R., Grove, J. Infection counter: Automated quantification of in vitro virus replication by fluorescence microscopy. Viruses. 8 (7), 201 (2016).
- Hudu, S. A., et al. Quantitative Hepatitis B e antigen: A better predictor of Hepatitis B virus DNA than quantitative Hepatitis B surface antigen. Clinical Laboratory. 64 (4), 443-449 (2018).
- Baltimore, D. RNA-dependent DNA polymerase in virions of RNA tumour viruses. Nature. 226 (5252), 1209-1211 (1970).
- Scolnick, E. M., Aaronson, S. A., Todaro, G. J., Parks, W. P. RNA dependent DNA polymerase activity in mammalian cells. Nature. 229 (5283), 318-321 (1971).
- Strick, L. B., Wald, A. Diagnostics for herpes simplex virus: is PCR the new gold standard. Molecular Diagnosis and Therapy. 10 (1), 17-28 (2006).
- Ramakrishnan, M. A. Determination of 50% endpoint titer using a simple formula. World Jouranl of Virology. 5 (2), 85-86 (2016).
- Kärber, G. Beitrag zue kollektiven Behandlung pharmakologischer pharmakologischer Reihenversuche. Archiv for Experimentelle Pathologie und Pharmakologie. 162 (4), 480-487 (1931).
- Reed, L. J., Muench, H. A simple method of estimating fifty percent endpoints. American Journal of Hygiene. 27 (3), 493-497 (1938).
- Spearman, C. The Method of ‘Right and Wrong Cases’ (Constant Stimuli) without Gauss’s formula. British Journal of Psychology. 2 (3), 227-242 (1908).
- Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. 1st edn. , (2017).
- Burrill, C. P., Strings, V. R., Andino, R. Poliovirus: generation, quantification, propagation, purification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , (2013).
- Karakus, U., Crameri, M., Lanz, C., Yanguez, E. Propagation and titration of influenza viruses. Methods in Molecular Biology. 1836, 59-88 (2018).
- Baz, M. Zika virus isolation, purification, and titration. Methods in Molecular Biology. 2142, 9-22 (2020).
- Coleman, C. M., Frieman, M. B. Growth and quantification of MERS-CoV infection. Current Protocols in Microbiology. 37 (1), 1-9 (2015).
