通过肿瘤大解剖增强肿瘤含量

共切片5个弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）FFPE组织块，所得切片在核酸提取前进行大解剖或不进行。提取的RNA在DLBCL90测定16上运行。大解剖样品运行两次，一次使用5μL的RNA储备浓度，但不超过300ng的总RNA输入，一次使用5μL稀释的RNA储备以匹配其各自未解剖对应物的RNA输入。表 2 概述了 DLBCL90 结果。 DLBCL由3种不同的起源细胞（COO）亚型组成，具有不同的治疗反应性，即GCB，ABC和称为未分类或UNC17，18的中间组。在 DLBCL 中也经常观察到涉及 MYC、BCL2 和/或 BCL6 单独或联合（双重或三次命中）的易位，特别是在 GCB 亚型19 中。DLBCL90 测定是其前身淋巴2Cx 临床测定的扩展，因此能够进行 DLBCL COO 亚型测定，但主要开发用于使用数字基因表达作为荧光原位杂交 （FISH） 替代方案来鉴定含有涉及 BCL2 的双重命中 （DH） 易位的样品 16，20。 表2 中的结果表明，宏观切割改变了COO或DHITsig状态，需要60%（3/5）的样本。 样本A的大解剖对COO调用没有影响，但将DHITsig调用从NEG更改为UNCLASS，并且无论大解剖样本RNA输入如何并且具有相似的概率评分（0.224，0.254），都观察到这种变化。相比之下，样本 C 的宏观剖析对 DHITsig 调用没有影响，但将 COO 调用从 GCB 更改为 UNC。同样，无论宏观解剖的样品RNA输入如何，都观察到这种变化。然而，在0.117时，对于RNA输入减少的大解剖样品，COO呼叫概率更接近0.1的呼叫阈值。与样本 A 类似，样本 E 的宏解剖对 COO 调用没有影响，但更改了 DHITsig 调用。然而，对于样本E，调用从UNCLASS更改为NEG，并且无论具有合理相似概率调用（0.849，0.833）的大解剖样本RNA输入如何，都这样做了。值得注意的是，这种对 DHITsig NEG 的调用更改具有生物学意义，因为样本 E 被发现为 ABC-DLBCL，并且据报道，在 GCB-DLBCL19 中仅观察到涉及 BCL2 的双重命中易位。 图1：使用切片机生成幻灯片安装的组织切片 （A）FFPE组织块由切片机卡盘固定到位并切割以产生连续FFPE组织切片的带状物。（B）使用预先浸泡的木棍，从切片机中收集丝带并将其转移到温水浴中。（C）水的温暖有助于消除组织带中的折痕。（D）通过将闭合的镊子放在两个部分的交界处并轻轻打开镊子，将单个FFPE组织切片从组织带中取出，镊子将切片彼此分开。（E）通过以一定角度浸没载玻片并从水中收集切片，然后轻轻地将侧面向组织切片移动，直到切片的边缘接触到载玻片。（F）一旦载玻片和切片接触，慢慢地将载玻片从水中取出，使组织切片与载玻片齐平。 请点击此处查看此图的大图。 图 2：苏木精和曙红 （H&E） 染色切片的病理学和组织学综述 （A，B） H&E 组织切片由董事会认证的病理学家进行显微镜检查。（三、四）一旦病理学家查看了整个组织并发现它不是100%的肿瘤组织，病理学家将使用标记物来包围组织的肿瘤区域。（英，女）将标记的H&E与原始FFPE组织块保持在一起表明并非所有组织都是肿瘤物质。 请点击此处查看此图的大图。 图3：组织样本。 该图像显示了病理学检查和肿瘤标记的H&Es（第1行），未处理的载玻片安装FFPE组织切片（第2行），去蜡化的载玻片安装的FFPE组织切片（第3行），去链烷化的载玻片安装的FFPE组织切片，并在载玻片背面追踪病理标记（第4行），用于演示该协议的5个样品（A-E）的去链烷化和宏观解剖的载玻片安装FFPE组织切片（第5行）。 请点击此处查看此图的大图。 图 4：FFPE 组织切片的脱蜡和宏观解剖： （A） 在通风橱中，安装在载玻片架中的 FFPE 组织在两次 d-柠檬烯洗涤和一次乙醇洗涤中洗涤。（乙、丙）洗涤后，所有的石蜡都被去除了，只有组织留在载玻片上，与预洗的对应物相比，切片现在是白色的，并且非常明显。（D）将脱蜡的载玻片安装的组织切片面朝下放置在其匹配的标记H&E的背面（E）然后使用精细或超细的笔尖永久标记物在脱脂载玻片的背面追踪H&E上的肿瘤区域标记（F）然后将标记的脱脂化载玻片安装的组织切片浸入甘油洗涤液中以抑制组织切片以进行收集。将载玻片从甘油中缓慢取出，并用纸巾擦拭载玻片的背面以除去多余的甘油，然后将载玻片纸面朝上放在工作台上。（G）使用干净的剃须刀片的平坦面，对组织进行宏观解剖，并在收集感兴趣的组织之前丢弃病理学家标记之外的不需要的组织，其沿着刀片的边缘聚集。（H）使用木棍从刀片边缘取出收集的组织。（I）然后将组织转移到预先标记的微管预填充组织消化缓冲液中，并准备进行核酸提取。 请点击此处查看此图的大图。 样品编号 整个组织 （a） 组织圆周面积 （b） 整个组织的总肿瘤含量（c） 通过大解剖增加肿瘤含量（d） 未宏观解剖 （e） 宏观解剖 （f） 活肿瘤百分比 % 其他 活肿瘤百分比 % 其他 提取的 5 μm 载玻片数量 核糖核酸浓度（纳克/微升） 提取的 5 μm 载玻片数量 核糖核酸浓度（纳克/微升） 示例 A 60 40 75 25 45 1.7 2 19.0 4 58.3 样品 B 60 40 65 35 39 1.7 1 34.0 2 60.0 示例 C 40 60 65 35 26 2.5 1 13.7 2 46.2 样品 D 35 65 90 10 32 2.9 1 57.3 2 60.0 样品 E 20 80 30 70 6 5.0 3 25.2 3 44.6 表1：病理学检查数据。 该表显示（a）按区域划分的整个组织切片中活肿瘤的百分比，（b）病理学家在细胞性审查期间圈出/标记的区域内活肿瘤的百分比，（c）整个组织的估计整体肿瘤细胞性（a x b），（d）通过大解剖实现的肿瘤细胞性的估计倍数增加， （e和f）提取的5μm未染色FFPE载玻片组织切片的数量以及匹配的非大解剖和大解剖样品的所得RNA浓度。%Other是指存在于给定样品中的所有其他组织，这些组织不是肿瘤组织，可以包括结缔组织，基质成纤维细胞，血管以及其他固有的基质元素。 请按此下载此表格。 样品编号 核糖核酸输入（纳克） 德宝90首席运营官电话 呼叫概率 德希奇电话 DHITS 位置概率 二次歧义否定概率 未宏解剖 示例 A 95.0 断续器 0.000 尼格 0.135 0.865 样品 B 170.0 断续器 0.000 尼格 0.032 0.968 示例 C 68.5 断续器 0.028 尼格 0.033 0.967 样品 D 286.5 美国广播公司 0.998 尼格 0.002 0.998 样品 E 126.0 美国广播公司 0.989 非阶级 0.212 0.788 宏观解剖 示例A_M 291.7 断续器 0.000 非阶级 0.224 0.776 示例B_M 300.0 断续器 0.000 尼格 0.016 0.984 示例C_M 231.2 非阶级 0.210 尼格 0.015 0.985 示例D_M 300.0 美国广播公司 0.999 尼格 0.002 0.998 示例E_M 223.2 美国广播公司 0.987 尼格 0.151 0.849 大解剖 / RNA 稀释 示例A_M 95.0 断续器 0.000 非阶级 0.254 0.746 示例B_M 170.0 断续器 0.000 尼格 0.023 0.977 示例C_M 68.5 非阶级 0.117 尼格 0.027 0.973 示例D_M 286.5 美国广播公司 0.999 尼格 0.002 0.998 示例E_M 126.0 美国广播公司 0.995 尼格 0.167 0.833 表2：DLBCL90数字基因表达测定结果。 在进行核酸提取之前，五个样品（A-E）要么没有进行大解剖，要么大解剖。所得RNA在DLBCL90测定中运行，其最大RNA输入体积为5μL。使用（a）5μL储备RNA运行每个大切割样品两次，除非可以等分试样为60 ng / μL，以及（b）稀释5μL储备RNA以匹配其非大解剖对应物的浓度/输入。后缀_M表示该样本已进行宏观解剖。 请按此下载此表格。