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생물학

종양 거대 해부를 통한 종양 내용 향상

Published: February 12, 2022
doi:
10.3791/62961
, ,
1Department of Research,Mayo Clinic, 2Department of Laboratory Medicine and Pathology,Mayo Clinic

Summary

이 프로토콜은 포르말린-고정된 파라핀-포매된 조직 샘플의 퍼센트 종양 함량을 증가시키는 방법을 제시한다.

Abstract

포르말린 고정 파라핀 포매(FFPE) 조직에서 비종양 조직을 오염시키는 존재는 게놈 연구를 크게 훼손시킬 수 있습니다. 본원에서 우리는 하류 핵산 추출을 수행하기 전에 원치 않는 조직을 제거하고 제거함으로써 조직 표본의 종양 함량 백분율을 증가시키도록 설계된 방법인 매크로 해부를 기술한다. FFPE 조직 블록을 절편화하여 4-5 μm 슬라이드 장착형 조직 절편을 생성하였다. 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색을 위해 대표 섹션이 제출되었으며 이후 보드 인증 병리학 자에 의해 검토되었습니다. 검토 중에 병리학자는 H & E에서 종양 조직의 영역을 확인하고 표시했습니다. 일단 완료되면, 표시된 H&E를 사용하여 동일한 조직 블록으로부터 일련의 염색되지 않은 절편의 절제를 안내하였다. 마크로해독의 효과를 입증하기 위해, 매칭된 마크로해부 및 비해부된 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL)으로부터 추출된 RNA를 DLBCL 아류형 및 BCL2 전좌 상태를 결정할 수 있는 디지털 유전자 발현 검정 상에서 실행하였다. 결과는 매크로 해부가 검사 된 샘플의 60 %에서 하위 유형 또는 BCL2 전좌 상태 호출을 변경했음을 보여주었습니다. 결론적으로, 거대 해부는 핵산 추출 전에 종양 농축을 수행하는 간단하고 효과적인 방법이며, 그 산물은 하류 게놈 연구에 자신있게 사용될 수 있습니다.

Introduction

포르말린-고정 파라핀-포매(FFPE) 조직은 정상적인 임상 진단 과정의 일부로서 수집되고 임상 조직 저장소에 보유되며, 암 연구1을 포함한 인간 연구를 위한 방대한 자원을 나타낸다. 인간 질병에 대한 우리의 이해가 깊어짐에 따라, 이전에 형태 학적 및 면역 표현형 특성에 기초한 단일 실체로 생각되었던 질병이 실제로 분자 서브 타이핑 분석이 필요한 별개의 분자 아형으로 구성되어 있다는 것이 점점 더 분명 해지고 있습니다. 결과적으로, 이들 아류형을 분별할 수 있는 고감도 게놈 분석이 점점 더 중요해지고 있다2. FFPE 조직은 고정 관련 문제로 인해 게놈 기술과 호환되지 않는 것으로 유명하지만 기술 및 프로토콜이 발전함에 따라 이러한 기술은 임상적으로 유 비쿼터스 조직 형식 3,4,5와 점점 더 호환되고 있습니다. 그러나, FFPE 조직은 종종 종양 및 비종양 조직 물질의 혼화제이며, 여기서 비종양 물질의 존재는 종종 원치 않으며, 높은 비율로 존재하는 경우, 게놈 분석의 결과를 상당히 훼손하고 영향을 미칠 수 있다6. 실제로, 60%의 최소 종양 함량이 그러한 분석에 자주 사용되며, 여기서 이 역치에 미치지 못하는 조직은 연구 기준(7)을 달리 충족함에도 불구하고 배제될 수 있다. 이것은 환자 조직이 소중하고 많은 수의 수집이 어려운 희귀 한 질병 환경에서 특히 문제가 될 수 있습니다.

마크로해부(macrodissection)는 정상 조직의 양을 줄임으로써 낮은 종양 함량의 영향을 최소화하는 방법이다3. 핵산 추출 전에 이러한 교란스러운 비종양 물질의 제거는 추출된 핵산의 종양 백분율 함량 및 따라서 종양 순도를 상당히 증강시킬 수 있다. 조직 절제술은 전문가 병리학 적 검토에 크게 의존하며, 여기서 종양 영역은 보드 인증 병리학 자8에 의해 갓 생성 된 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색 조직 섹션에서 확인되고 동그라미화됩니다. 그런 다음 동그라미로 표시된 H&E는 원치 않는 조직과 표적 조직의 제거 및 수집을 각각 안내하는 데 사용됩니다. 이 프로토콜은 Mayo Clinic의 AIDS 및 Cancer Specimen Resource (ACSR) Technical Core Laboratory에서 수행 된 조직 수확을 통한 병리학 적 검토에서 거시 해부의 단계를 설명합니다.

Protocol

모든 샘플을 수집하여 승인된 메이요클리닉 IRB 프로토콜(PR16-000507 및 PR2207-02)에 따라 사용하였다. 1. 시료 준비 조직 부유 수조를 켭니다. 온도를 39 °C로 설정하고 물이 온도에 도달하도록하십시오. 나무 컬렉션 스틱을 수조에 담그십시오. 절편화될 FFPE 조직 블록을 식별하고 검색한다. 용매 세척을 견딜 수 있는 조직학 등급 영구 마커를 사용하여 현미경 슬라이드를 사전 라벨링합니다. 마이크로톰을 사용하여 FFPE 블록을 단면화하십시오. 각 블록에 대해 단면당 4-5μm의 두께로 최소 2개의 전체 얼굴 섹션을 절단합니다(그림 1A). 조직 절편의 갓 자른 리본을 슬라이드 장착을 위해 미리 예열된 조직 부유조로 옮깁니다(그림 1B, C).참고: 따뜻한 물은 부분의 주름을 “다림질”하는 데 도움이 됩니다(그림 1C). 각 섹션을 순차적으로 처리할 때 포셉을 사용하여 리본에서 단일 섹션을 분리합니다(그림 1D). 미리 레이블이 지정된 현미경 슬라이드에서 단일 섹션을 수집합니다. 현미경 슬라이드를 단면 아래의 비스듬히 잠기고 조직 섹션의 가장자리가 슬라이드에 닿도록 슬라이드를 배치합니다(그림 1E). 조직 섹션과 접촉한 후 슬라이드를 부유식 욕조에서 천천히 당겨 조직 섹션이 물에서 나올 때 슬라이드에 대해 플러시를 곧게 펴도록 합니다(그림 1F). 슬라이드 당 1 개의 조직 섹션을 마운트하고 모든 섹션이 수집 될 때까지 반복하십시오. 슬라이드 장착형 조직 절편을 실온(RT)에서 완전히 건조시키십시오. 2. 병리학 적 검토 각 블록9에 대해 하나의 대표적인 조직 절편에 대해 H&E 염색을 수행한다. 갓 염색 된 H & Es를 제출하여 보드 인증 병리학 자의 병리학 적 검토를 받으십시오.참고: 검토 중에 병리학자는 각 조직의 종양 함량 비율을 결정 및 기록하고 각 H&E 슬라이드의 종양 영역을 원으로 표시합니다( 그림 2 및 그림 3, 행 1 참조). 표 1은 도 3, 행 1에 도시된 샘플 A-E에 대한 H&E의 병리학적 검토 동안 결정된 세포성에 의한 종양 함량 백분율을 개략적으로 설명한다. 종양 함량이 <60%인 절편은 매크로 해부7이 필요합니다. 핵산 추출에 필요한 절편의 수는 원형의 종양 영역의 크기에 따라 달라진다. 프로토콜의 섹션 1에서 섹션이 충분하지 않고 추가 절단이 가능한 경우 추가 섹션을 잘라야 할 수도 있습니다. 3. 탈파라핀화 흄 후드에서 희석되지 않은 조직학 등급 d-Limonene 또는 d-Limonene 기반 용매로 유리 스테인딩 접시 2 개를 미리 채우고 희석되지 않은 200 증거 분자 등급 에탄올로 1 잔 스테인딩 접시를 미리 채 웁니다.주의: d-리모넨이 피부와 눈에 닿지 않도록 하고, 증기나 안개의 흡입을 피하며, 발화원을 멀리하십시오. 에탄올을 열, 불꽃 및 화염으로부터 멀리하고, 피부나 눈과의 유출 및 접촉을 피하고, 환기를 잘하고, 증기를 호흡하지 마십시오.주: 랙된 슬라이드를 잠길 수 있도록 접시를 충분히 채우십시오(그림 4A). 표시된 20-슬라이드 염색 접시를 채우기 위해 250 mL가 필요합니다. 40 슬라이드마다 d-리모넨 및 에탄올 세척을 교체하십시오. D-리모넨(C10H16)은 조직학적 방법론에서 더욱 보편화되고 있는 자일렌에 대한 대안이고, 유사하게 효과적이며, 독성이 적고, 추출 후 양질의 핵산10,11,12,13,14를 산출한다. 비록 이 프로토콜이 더 많은 생체친화성 대안들(15)을 사용하여 수행될 수 있지만, 추출된 핵산 품질에 대한 그들의 효과는, 만약 있다면, 결정되어야 한다. 스테인팅되지 않은 FFPE 조직 장착 슬라이드를 유리 코플린 슬라이드 랙에 랙합니다(그림 4A, 삽입). 랙된 슬라이드를 d-리모넨에 담그고 1 분 동안 2 분 동안 세척하십시오. 처음 20 초 동안 부드럽게 동요하십시오.주: 세척 사이의 이월을 최소화하기 위해 세척에서 슬라이드 랙을 분리할 때 랙이 잠깐 방전되도록 한 후 티슈 페이퍼의 랙 바닥을 부드럽게 닦아 과도한 세척을 제거하십시오. 랙된 슬라이드를 희석되지 않은 D-리모넨에 담그고 2분 동안 2 분 동안 세척하십시오. 처음 20 초 동안 부드럽게 동요하십시오. 랙을 분리, 드레인 후 다시 닦으십시오. 랙된 슬라이드를 에탄올 세척에 2분 동안 잠수시키고; 처음 20 초 동안 부드럽게 동요하십시오. 랙을 분리하고 흡수 조직에 올려 놓아 배수하십시오. 슬라이드를 적어도 10 분 동안 공기 건조시키되 2 시간을 넘지 않도록하십시오. 3. 매크로 해부 벤치에서 코플린 유리 병에 DNase / RNase 유리 물에 50 mL의 3 % 글리세롤을 미리 채 웁니다.참고: 매 40 슬라이드 후에 글리세롤 세척을 교체하십시오. 마이크로튜브 당 160 μL의 조직 소화 완충액으로 1.5 mL 마이크로튜브를 사전 라벨링하고 프리필한다.참고: 마크로해독 후 수행된 핵산 추출은 DNA/RNA FFPE 추출 키트(표 자료)를 사용했습니다. 따라서, 이 프로토콜에 사용된 조직 소화 완충액은 10 μL의 프로테이나제 K와 150 μL의 PKD 완충액으로 구성되었다. H&E의 병리학적 표시를 탈파라핀화된 조직 슬라이드의 뒤쪽으로 추적합니다.참고: 탈파라핀화되지 않은 조직(그림 3, 행 2 및 그림 4B)과 비교했을 때, 탈파라핀화된 조직은 흰색이며 매우 잘 보입니다(그림 3, 행 3 및 그림 4C). 이러한 가시성과 탈파라핀화된 조직 특징의 식별성이 높아져 거대 해부를 가능하게 합니다. H&E를 벤치에 내려놓고 H&E가 검토한 일치하는 병리학자의 뒷면에 탈파라핀화된 슬라이드의 앞쪽을 놓습니다(그림 4D). 탈파라핀화된 조직을 H&E 조직과 정렬합니다(그림 4E). 병리학자의 표식을 추적하는 것은 거시 해부 과정에서 중요한 단계이며, 가능한 한 정확하게 이러한 표시를 재현하기 위해주의를 기울여야합니다. 이는 샘플 B, D 및 E와 같은 작고 단절된 조직에 특히 어려울 수 있습니다(그림 3, 그림 4E 및 그림 4E 인셋 i). 추적을 돕기 위해, 병리학자가 그린 표시를 추적하기 위해 잉크가 많은 미세 또는 초미세 니브 마커 (그림 4E, inset ii)를 사용해야합니다. 에탄올 와이프는 오류를 제거하고 필요한 경우 재추적을 허용하는 데 유용 할 수 있습니다. 이제 표시된 탈파라핀화된 슬라이드 조직을 위로 향하게 하고 깨끗한 면도날의 모서리로 마커의 선을 추적하여 종양 영역의 가장자리를 미리 자릅니다. 각 슬라이드를 순차적으로 처리하고, 탈파라핀화된 슬라이드를 3% 글리세롤 용액에 담그십시오. 슬라이드를 천천히 제거하기 전에 조직이 완전히 잠겨 있는지 확인합니다(그림 4F).참고 : 글리세롤 딥의 목적은 조직 수집을 돕기 위해 조직을 약화시키는 것뿐만 아니라 수집 된 조직을 배치해야하는 조직과 플라스틱 마이크로 튜브 사이에 반발을 일으킬 수있는 정전기의 축적을 줄이는 것입니다. 과도한 글리세롤 용액을 제거하기 위해 조직으로 슬라이드 뒷면을 부드럽게 닦고, 슬라이드를 벤치에 눕히고, 측면을 아래로 향하게 닦아냅니다. 조직을 1-2 분 동안 잠깐 공기 건조시킵니다.참고 : 과도한 글리세롤을 추출 과정으로 옮기면 핵산 추출의 수율과 품질에 부정적인 영향을 줄 수 있습니다. Tissues는 약간 습기가 있어야하지만 수집 할 때 눈에 띄게 젖지 않아야합니다. 관심 있는 종양 영역이 슬라이드에 있는 위치에 따라 면도날의 평평한 가장자리를 사용하여 (a) 면도기를 사용하여 슬라이드에서 관심 있는 조직을 긁어내거나 수집하거나 (b) 관심 있는 종양 조직을 수집하기 전에 먼저 비종양 조직을 제거하고 폐기합니다(그림 3).참고: 수집된 조직은 블레이드 바닥에서 수집되거나 굴러가는 경향이 있습니다(그림 4G). 나무 스틱을 사용하여 수집된 조직을 블레이드(그림 4H 및 인셋)에서 제거하고 적절한 사전 라벨이 부착되고 미리 채워진 마이크로튜브(그림 4I)로 옮깁니다.참고 : 소화 완충액은 나무 따기에서 조직을 액체로 “당기는”역할을합니다. 핵산 추출을 진행한다.참고: 핵산 추출은 제조업체의 지침에 따라 DNA/RNA FFPE 추출 키트를 사용하여 완료되었으며, 생성된 핵산은 UV-vis 분광광도계를 사용하여 정량화되었습니다. 생성된 RNA를 디지털 유전자 발현 프로파일링 기반 DLBCL90 검정16 상에서 실행하였다.

Representative Results

총 5개의 미만성 거대 B 세포 림프종(DLBCL) FFPE 조직 블록을 절개하였고, 생성된 절편은 핵산 추출 전에 대량해부되거나 또는 그렇지 않은 것으로 나타났다. 추출된 RNA를 DLBCL90 분석16에서 실행하였다. 마크로디스크션된 샘플은 한 번은 5 μL의 RNA 스톡 농도를 사용하되 총 RNA 투입량의 300 ng 이하를 사용하고 한 번은 5 μL의 RNA 스톡을 사용하여 각각의 비해부된 대응물의 RNA 입력과 일치하도록 희석하여 두 번 실행하였다. DLBCL90 결과는 표 2에 요약되어 있습니다. DLBCL은 상이한 치료 반응성을 갖는 3개의 별개의 기원 세포(COO) 아류형, 즉 GCB, ABC 및 분류되지 않은 또는 UNC17,18로 알려진 중간 그룹으로 구성된다. MYC, BCL2 및 BCL6을 단독으로 또는 조합하여 포함하는 전좌(이중 또는 삼중 히트)는 또한 DLBCL에서, 특히 GCB 서브타입19에서 빈번하게 관찰된다. DLBCL90 분석은 전임자인 Lymph2Cx 임상 분석의 확장으로, 따라서 DLBCL COO 아형 결정이 가능하지만 형광 계내 혼성화(FISH)16,20의 대안으로 디지털 유전자 발현을 사용하여 BCL2와 관련된 이중 히트(DH) 전좌를 보유하는 샘플을 확인하기 위해 주로 개발되었습니다. 표 2의 결과는 매크로 해부가 COO 또는 DHITsig 상태 요구가 조사된 샘플의 60%(3/5)를 요구한다는 것을 보여준다. 샘플 A의 매크로 해부는 COO 콜에 아무런 영향을 미치지 않았지만 DHITsig 콜을 NEG에서 UNCLASS로 변경했으며, 이러한 변화는 매크로 해부 된 샘플 RNA 입력과 유사한 확률 점수 (0.224, 0.254)와 관계없이 관찰되었습니다. 대조적으로, 샘플 C의 매크로 해부는 DHITsig 콜에 아무런 영향을 미치지 않았지만 COO 콜을 GCB에서 UNC로 변경했다. 다시, 이러한 변화는 거대해부된 샘플 RNA 입력과 무관하게 관찰되었다. 그러나, 0.117에서, COO 콜 확률은 감소된 RNA 입력을 갖는 거대해부된 샘플에 대한 콜 임계값 0.1에 더 가까웠다. 샘플 A와 유사하게, 샘플 E의 매크로 해부는 COO 콜에 영향을 미치지 않았지만 DHITsig 콜을 변경하였다. 그러나, 샘플 E의 경우 호출은 UNCLASS에서 NEG로 변경되었고, 상당히 유사한 확률 호출(0.849, 0.833)을 갖는 매크로 해부된 샘플 RNA 입력과 무관하게 그렇게 되었다. 특히, DHITsig NEG에 대한 이러한 콜 변화는 샘플 E가 ABC-DLBCL로 발견되었고, BCL2를 수반하는 이중 히트 전좌가 GCB-DLBCL19에서 독점적으로 관찰되는 것으로 보고되었다는 점을 감안할 때 생물학적으로 의미가 있다. 도 1: 마이크로톰을 이용하여 슬라이드 장착형 조직 절편을 생성한다. (A) 마이크로톰 척에 의해 제자리에 유지된 FFPE 조직 블록을 절단하여 순차적 FFPE 조직 절편의 리본을 생성한다. (B) 미리 담근 나무 막대기를 사용하여 리본을 마이크로 톰에서 수집하여 따뜻한 수조로 옮깁니다. (C) 물의 따뜻함은 조직 리본의 주름을 다림질하는 데 도움이됩니다. (d) 개별 FFPE 조직 절편은 두 절편의 접합부에 닫힌 포셉을 배치하고 포셉을 부드럽게 열어 조직 리본으로부터 제거되며, 이는 서로 절편을 분리한다. (e) 섹션은 유리 슬라이드를 비스듬히 잠그고 단면의 가장자리가 유리 슬라이드에 닿을 때까지 조직 섹션 쪽으로 측면을 부드럽게 움직여 물에서 수집됩니다. (F) 슬라이드와 섹션이 닿으면 물에서 슬라이드를 천천히 제거하여 조직 섹션이 슬라이드에 대해 플러시되도록 합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 2: 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색 절편의 병리학 및 조직학적 검토. (A,B) H&E 조직 섹션은 보드 인증 병리학자에 의해 현미경 검토를 거칩니다. (C,D) 병리학자가 전체 조직을보고 100 % 종양 조직이 아니라는 것을 알게되면 병리학자는 마커를 사용하여 조직의 종양 영역을 둘러싸게됩니다. (E, F) 원래의 FFPE 조직 블록에 대해 표시된 H & E를 보유하는 것은 모든 조직이 종양 물질이되는 것은 아니라는 것을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 3: 조직 샘플. 이 이미지는 병리학적으로 검토되고 종양 마킹된 H&Es (행 1), 처리되지 않은 슬라이드 장착형 FFPE 조직 절편 (행 2), 탈파라핀화 슬라이드 장착형 FFPE 조직 절편(행 3), 탈파라핀화 슬라이드 장착형 FFPE 조직 절편(행 4), 이 프로토콜을 입증하는 데 사용된 5개의 샘플(A-E)에 대한 탈파라핀화 및 마크로해부된 슬라이드 장착형 FFPE 조직 절편(행 5)을 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: FFPE 조직 절편의 탈파라핀화 및 매크로-해부: (A) 흄 후드에서, 슬라이드 랙에 장착된 FFPE 조직은 두 개의 d-리모넨 세척 및 하나의 에탄올 세척으로 세척된다. (B,C) 세척 후, 모든 파라핀이 제거되었고, 조직 만 슬라이드에 남아 있으며, 이는 이제 미리 씻은 것에 비해 흰색이며 눈에 잘 띄게됩니다. (D) 탈파라핀화된 슬라이드-장착된 조직 섹션은 그의 일치하는 마크된 H&E의 뒷면에 아래로 향하게 배치된다. (E) H&E의 종양 영역 표시는 미세 또는 초미세 니브된 영구 마커를 사용하여 탈파라핀화된 슬라이드의 뒷면에서 추적된다 (F) 표시된 탈파라핀화된 슬라이드-장착된 조직 섹션은 글리세롤 세척에 담근 후 수집을 위해 조직 섹션을 감쇠시킨다. 슬라이드는 글리세롤로부터 천천히 제거되고, 슬라이드 조직을 벤치에 정면으로 올려 놓기 전에 과도한 글리세롤을 제거하기 위해 조직으로 닦아냅니다. (g) 깨끗한 면도날의 편평한 측면을 사용하여, 조직은 거대 해부되고, 병리학자 표식의 외부의 원치 않는 조직은 블레이드의 가장자리를 따라 수집되는 관심있는 조직을 수집하기 전에 폐기된다. (H) 나무 막대기는 칼날의 가장자리에서 수집 된 조직을 제거하는 데 사용됩니다. (I) 조직은 미리 표지된 마이크로튜브 미리 채워진 조직 소화 완충액으로 옮겨지고 핵산 추출을 위해 준비된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 샘플 ID 전체 조직 (a) 조직의 동그라미 영역 (b) 전체 조직의 전체 종양 함량 (c) 대형해부에 의한 종양 함량의 증가를 접는다 (d) 매크로 해부되지 않음(e) 매크로 해부 (f) % 생존 가능한 종양 % 기타 % 생존 가능한 종양 % 기타 추출된 5 μm 슬라이드 수 RNA conc (ng/μL) 추출된 5 μm 슬라이드 수 RNA conc(ng/μL) 샘플 A 60 40 75 25 45 1.7 2 19.0 4 58.3 샘플 B 60 40 65 35 39 1.7 1 34.0 2 60.0 샘플 C 40 60 65 35 26 2.5 1 13.7 2 46.2 샘플 D 35 65 90 10 32 2.9 1 57.3 2 60.0 샘플 E 20 80 30 70 6 5.0 3 25.2 3 44.6 표 1: 병리학 검토 데이터. 표는 (a) 전체 조직 단면에서 생존 가능한 종양의 백분율, (b) 세포성에 의한 검토 동안 병리학자가 원으로 표시/표시한 영역에서 생존 가능한 종양의 백분율, (c) 전체 조직의 추정된 전체 종양 세포성(a x b), (d) 거시해부로 달성된 종양 세포성의 추정된 배수 증가를 보여주며, (e 및 f) 5 μm의 수염색되지 않은 FFPE 슬라이드-장착된 조직 절편을 매칭된 마크로디스크해 및 마크로해부된 샘플에 대해 생성된 RNA 농도로 추출하였다. %기타는 종양 조직이 아닌 주어진 샘플에 존재하는 다른 모든 조직을 의미하며, 결합 조직, 기질 섬유아세포, 혈관 및 다른 고유 기질 요소를 포함할 수 있다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 샘플 ID RNA 입력 (ng) DLBCL90 COO 통화 DLBCL90 호출 확률 DHITsig 통화 DHITsig pos 확률 DHITsig 부정 확률 매크로 해부되지 않음 샘플 A 95.0 증권 시세 표시기 0.000 네그 0.135 0.865 샘플 B 170.0 증권 시세 표시기 0.000 네그 0.032 0.968 샘플 C 68.5 증권 시세 표시기 0.028 네그 0.033 0.967 샘플 D 286.5 증권 시세 표시기 0.998 네그 0.002 0.998 샘플 E 126.0 증권 시세 표시기 0.989 언클래스 0.212 0.788 매크로 해부 샘플 A_M 291.7 증권 시세 표시기 0.000 언클래스 0.224 0.776 샘플 B_M 300.0 증권 시세 표시기 0.000 네그 0.016 0.984 샘플 C_M 231.2 언클래스 0.210 네그 0.015 0.985 샘플 D_M 300.0 증권 시세 표시기 0.999 네그 0.002 0.998 샘플 E_M 223.2 증권 시세 표시기 0.987 네그 0.151 0.849 Macrodissected & RNA 희석 샘플 A_M 95.0 증권 시세 표시기 0.000 언클래스 0.254 0.746 샘플 B_M 170.0 증권 시세 표시기 0.000 네그 0.023 0.977 샘플 C_M 68.5 언클래스 0.117 네그 0.027 0.973 샘플 D_M 286.5 증권 시세 표시기 0.999 네그 0.002 0.998 샘플 E_M 126.0 증권 시세 표시기 0.995 네그 0.167 0.833 표 2: DLBCL90 디지털 유전자 발현 분석 결과. 다섯 개의 샘플(A-E)은 핵산 추출이 수행되기 전에 마크로해부되지 않았거나 마크로디스크해부되지 않았다. 생성된 RNA를 DLBCL90 검정 상에서 실행하였고, 이를 위해 최대 RNA 입력 부피는 5 μL이다. 비-거대-해부된 샘플은 5 μL의 스톡 RNA를 사용하여 실행되었다. 각 마크로해부된 샘플은 (a) 60ng/μL의 분취량이 가능하지 않은 한 5μL의 스톡 RNA를 사용하여 두 번 실행하였고, (b) 5μL의 스톡 RNA를 사용하여 그들의 비-거대해부된 대응물의 농도/투입량과 일치하도록 희석하였다. 접미사 _M는 해당 샘플이 매크로 해부되었음을 나타냅니다. 이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

FFPE 조직은 종종 종양 및 비종양 조직의 이질적인 혼화제이다. 고감도 게놈 검사는 임상 및 연구 환경 모두에서 점점 더 보편화되고 있지만 비 종양 조직을 오염시키는 존재로 인해 혼란 스러울 수 있습니다. 실제로, 게놈 연구에 60 %의 최소 종양 함량이 자주 권장됩니다. 종양 백분율은 종양 물질에 의해 점유된 조직의 면적 또는 조직 내 종양 세포의 비율에 의해 결정될 수 있다. 면적별 종양은 종양 순도에 대해 일반적으로 사용되는 메트릭이지만 항상 조직에 대한 정확한 설명을 묘사하는 것은 아닙니다. 1000 개의 세포가있는 두 개의 조직을 생각해보십시오.이 중 500 개가 종양 세포입니다. 조직 A에서, 500개의 비-종양 세포는 종양 세포의 그것과 유사한 부피를 갖는 기질 세포이다. 이 조직에서, 종양의 백분율은 세포성 및 면적 모두에 의해 50%로 간주될 수 있다. 조직 B에서, 500개의 비종양 세포는 종양 세포의 4배에 달하는 부피를 가진 지방 세포이다. 이 조직에서, 백분율 종양은 여전히 세포성에 의해 50 %이지만 면적에 의해 20 %이다. 세 번째 조직인 조직 C는 500개의 종양 세포와 400개의 지방 세포, 800개의 기질 세포로 구성되어 있으며, 부피는 각각 종양 세포의 4배와 0.5배입니다. 100 개의 지방 세포가 800 개의 기질 세포의 부피와 동일하다는 것을 감안할 때, 조직 C의 백분율 종양은 세포성 (500/1700)에 의해 29 %이지만 여전히 면적 기준으로 20 %입니다. 조직 D는 또한 1x, 4x 및 0.1x의 부피비를 갖는 종양, 지방 및 기질 세포로 구성된다. 그러나, 세포의 수는 각각 400, 10 및 720이다. 따라서, 조직 D의 백분율 종양은 세포성(400/1130)에 의해 35%이지만 면적에 의해 78%이다. 이러한 예는 지나치게 단순하며 실제 조직 조성을 반영하지는 않지만 조직 조성의 중요성과 면적 및 세포성별 종양 함량 차이를 명확하게 전달합니다. 중요하게는, 하류 핵산 추출을 위한 종양 함량을 풍부하게 할 때, 종양 세포성은 종양 세포보다 더 많은 비종양 세포로부터 게놈 물질을 추출하는 고조된 혼란 가능성으로 인해 더욱 중요한 특성이다. 이것은 백분율 세포성 측면에서 조직의 종양 함량을 평가할 필요성을 강조 할뿐만 아니라 비 종양 조직의 잠재적 인 부정적인 영향을 최소화하기 위해 원치 않는 조직을 절제해야 할 필요성을 강조합니다. 조직 농축에 사용할 수있는 몇 가지 방법이 있으며, 주요 방법은 매크로 해부와 미세 해부입니다.

이 프로토콜에 설명된 방법인 매크로 해부(Macrodissection)는 비교적 빠르고 간단하며 비용이 많이 들거나 특수 장비가 필요하지 않습니다. 매크로 해부는 종양 함량을 크게 향상시킬 수 있지만, 비 종양 물질을 완전히 제거하지는 않는다는 것을 이해하는 것이 중요합니다. 매크로 해부의 목적은 원치 않는 조직으로부터 유래하는 “소음”을 줄이기 위해 원치 않는 조직의 배제를 통해 관심있는 조직을 충분히 풍부하게하는 것이며, 이는 차례로 관심있는 조직으로부터의 관심 신호를 향상시킬 수 있습니다. 따라서, 마크로해독 매개 종양 농축은 관심있는 마커, 특히 낮은 풍부도 또는 불량한 발현을 갖는 종양 특이적 분자 마커를 더 잘 검출하기 위해 신호 대 잡음비를 향상시키는 방법이다. 그러나 매크로 해부는 면도날과 같은 거친 도구에서 제공하는 정밀도가 부족하기 때문에 한계가 있으며 병리학 자 마커의 선 두께와 병리학자 H & E 경계를 추적 할 때 발생할 수있는 잠재적 인 오류로 인한 정밀도 문제에 취약합니다. 상기 언급된 바와 같이, 종양 자체 내에 내포된 고유 및 종양 유도 기질 요소(즉, 결합 조직, 기질 섬유아세포, 혈관, 양성 반응성 림프구, 대식세포)의 존재로 인해 100% 종양 순도를 달성하는 것은 불가능하다. 실제로, 많은 침습적 또는 확산성 침윤성 악성종양은 강력한 desmoplastic 기질 반응을 유도하여, 기질 섬유아세포 및 다른 비-신생물성 세포 유형과 밀접하게 혼합되는 종양 세포의 클러스터를 초래한다; 여기서 췌장암 조직(21)과 같은 이러한 기질 반응 패턴과 관련된 종양은 수동 거시해부보다는 디지털 유도된 미세 해부로부터 더 많은 이익을 얻을 수 있다.

수동 미세 해부는 바늘 또는 메스를 사용하여 조직 특정 세포 또는 집단의 식별, 해부 및 분리를 돕기 위해 현미경 하에서 수행되며 매크로 해부(22)에 비해 정밀도가 증가되는 장점이 있다. 그러나 수동 미세 해부술은 종양 함량이 낮거나 수동 해부와 양립 할 수없는 복잡한 기능을 가진 복잡한 조직에 필요한 기교가 부족한 힘든 과정입니다. 이러한 조직은 레이저 포획 미세 해부와 같은 고정밀 자동화 방법을 사용하여 해부 할 수 있습니다. 실제로, 디지털 유도된 미세 절제술은 췌장암 조직(23)에서의 수동 거대 해부(macrodissection)에 비해 더 높은 비율의 종양 내용물을 산출하는 것으로 나타났다. 그러나 전문화되고 값 비싼 장비 및 고도로 숙련 된 개인의 필요성과 같은 이러한 고정밀 자동화 방법의 단점은 워크 플로우로의 통합을 방해했습니다. de Bruin et al.의 연구는 유전자 발현 프로파일링에 대한 매크로 해부와 레이저 포획 미세 해부 (LCM)의 효과를 비교한 결과, LCM 샘플은 낮은 총 RNA 수율 (평균 30ng)을 가지며 cDNA 라이브러리 준비 입력 역치24를 충족시키기 위해 두 차례의 mRNA 증폭이 필요하다는 것을 발견했습니다. 저자들은 생성된 LCM 유전자 발현 프로필이 거대 해부된 프로파일이 비종양 기질 기여에 의해 영향을 받는 것보다 mRNA 증폭의 라운드에 의해 더 많은 영향을 받았다는 것을 발견하고, 거대 해부가 신뢰할 수 있는 유전자 발현 데이터를 생성하는데 적절하게 사용될 수 있다는 결론을 내렸다24.

NanoString 디지털 유전자 발현 프로파일링의 중요한 이점은, 특히 고도로 분해된 FFPE 유래 RNA로 작업할 때, RNA 증폭 또는 cDNA 라이브러리의 준비와 같은 효소 의존적 과정이 필요하지 않다는 것이다. 그러나, 검정은 전형적으로 총 RNA 25,26의 50-300 ng 사이의 입력에 대해 최적화되며, 이는 de Bruin etal.24의 발견에 기초하여, 조직 투입을 증가시키지 않으면서 미세해부된 조직과 양립할 수 없을 수 있다; 조직 샘플이 외과 적 절제술보다는 작은 생검으로 점점 더 수집되는 시대에 불리한 요구. DLBCL90 분석에 사용된 RNA 입력량은 거대 해부 및 비해부 조직 모두에 대해 68.5-300 ng의 범위였다. 결과는 매크로 해부로 인해 검사 된 샘플의 60 %에서 콜 변화가 발생했으며 이러한 변화는 매크로 해부 된 샘플의 RNA 입력과 관계없이 관찰되었음을 보여줍니다. 그러나 낮은 RNA 입력에 대한 COO 확률은 COO GCB / UNC 확률 호출 임계 값을 침범했으며, 임계 값은 GCB의 경우 0 ~ <0.1, UNC의 경우 0.1-0.9, ABC 호출20의 경우 >0.9 ~ 1.0입니다. 주요 DLBCL COO 하위 유형은 GCB 및 ABC로, 모든 DLBCL 사례의 41 %와 44 %를 차지하며 UNC는 두 가지 중간 그룹을 대표하고 ABC는 가장 공격적인20,27입니다. 따라서, 샘플 C의 대량해독시 COO 콜 변화가 GCB에서 ABC로의 COO 서브타입의 솔직한 변화를 야기하지는 않았지만, GCB에서 UNC로의 변화는 보다 공격적인 질병으로의 전환을 시사할 수 있다. 더욱이, 최근의 연구들은 UNC 아류형이 단순히 중간 아류형이 아니며, 잠재적으로 아류형-특이적 치료적 이용가능한 속성(28)을 보유할 수 있다는 것을 나타낸다. 유사하게, 샘플 A 및 E의 대량분리는 DHITsig 호의에서 DH 음성에서 DH 양성으로의 솔직한 변화를 일으키지 않았고, 또는 그 반대의 경우도 마찬가지였다. 그러나, 거시해부 시 GCB 샘플(샘플 A)이 NEG에서 UNCLASS로, ABC 샘플(샘플 E)이 UNCLASS에서 NEG로 이동하는 것은 BCL2를 수반하는 이중 히트 전좌가 배타적으로 GCB 현상인 것으로 보고됨에 따라 생물학적으로 적절하다(19). 전좌는 임상 환경에서 FISH에 의해 전통적으로 그리고 유비쿼터스하게 검출되지만, 검출을 위해 덜 관여하고 시간이 많이 걸리는 대안을 식별하기위한 추진력이 커지고 있습니다. DLBCL90 분석은 이러한 요구를 해결하는 중요한 도구이며, 이 분석법이 임상 진단29에 사용되는 FISH 프로브에 대한 전좌를 검출할 수 있다는 발견에 의해 그 사용에 대한 근거가 강화된다.

위에서 설명한 매크로 해부 프로토콜은 연구자가 일반적으로 사용되는 연구 포함 기준 임계 값 아래로 떨어지는 조직 샘플의 종양 함량을 증가시킬 수있게 해주는 간단한 방법을 설명합니다. 연구 워크 플로우에 매크로 해부를 포함하면 연구자는 종양 함량을 증가시킴으로써 연구 배제에서 종양 밀도가 낮은 조직을 구출 할 수 있습니다. 차례로, 이것은 결과 RNA 및 DNA 용출물이 게놈 조사 하에서 종양을 나타낸다는 자신감을 증가시킨다. 조직 해부를 위한 다른 더 정확한 방법이 존재하지만, 보다 광범위하고, 비침윤적이며, 시트형이거나, 고체 방식으로 성장하는 종양의 경우, 거대 해부로 충분할 가능성이 높습니다. 여기에 제시된 결과는 게놈 분석 및 매크로 해부에서 종양 순도의 중요성을 강조하여 이를 달성하기위한 신뢰할 수있는 도구로서 강조합니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 NIH가 후원하는 AIDS 및 암 표본 자원 (ACSR, UM1 CA181255-2)이 생물 표본 과학 프로그램에 따라 지원합니다. 비디오는 촬영되었고 포스트 프로덕션 편집은 Mayo Clinic Media Services에서 수행했습니다.

Materials

200-proof ethanol Decon 2701
AllPrep DNA/RNA FFPE Kit Qiagen 80234 DNA/RNA FFPE extraction kit
Coplin pots Various x
DLBCL90 probes NanoString various Digital gene expression profiling based DLBCL90 assay
d-Limonene VWR 89376-092
Forceps Various x
Glass micrscope slides FisherBrand 12-550-15
Glycerol VWR 0854-1L
Master kits NanoString various
Microtome Leica RM2265
Microtubes Ambion AM12400
NanoDrop One Thermo Scientific ND-ONE-W Spectrophotometer for DNA, RNA and protein qualitation
nCounter NanoString x Digital gene expression profiling platform used to run the DLBCL90 assay
Permanent marker Electrib Microscope Sciences 72109-12
Razor blade dispenser Electrib Microscope Sciences 71985-10
Razor blades Electrib Microscope Sciences 71985-23
Tissue digestion buffer Qiagen 80234
Ultrapure water VWR SH30538.02
Waterbath Triangle Biomedical Sciences TFB-120
Wooden stick FisherBrand 22363158
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References

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Wisner, L., Larsen, B., Maguire, A. Enhancing Tumor Content through Tumor Macrodissection. J. Vis. Exp. (180), e62961, doi:10.3791/62961 (2022).
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