Использование фагового дисплея для разработки модуляторов вариантов убиквитина для лигазов E3
Summary
Убиквитинация является критической посттрансляционной модификацией белка, дисрегуляция которой была вовлечена в многочисленные заболевания человека. Этот протокол подробно описывает, как фаговый дисплей может быть использован для выделения новых вариантов убиквитина, которые могут связывать и модулировать активность лигазов E3, которые контролируют специфичность, эффективность и паттерны убиквитинирования.
Abstract
Убиквитин представляет собой небольшой белок 8,6 кДа, который является основным компонентом системы убиквитин-протеасома. Следовательно, он может связываться с разнообразным массивом белков с высокой специфичностью, но низкой аффинностью. С помощью фагового дисплея варианты убиквитина (UbV) могут быть спроектированы таким образом, что они демонстрируют улучшенное сродство к убиквитину дикого типа и сохраняют специфичность связывания с целевыми белками. Фаговый дисплей использует библиотеку фагемидов, в соответствии с которой белок оболочки pIII нитевидного бактериофага M13 (выбранный потому, что он отображается снаружи на поверхности фага) сливается с UbVs. Специфические остатки убиквитина дикого типа человека мягкие и рандомизированные (т.е. существует уклон в сторону нативной последовательности диких типов) для генерации UbV, чтобы избежать вредных изменений в конформации белка при одновременном введении разнообразия, необходимого для содействия новым взаимодействиям с целевым белком. Во время процесса отображения фагов эти UbV экспрессируются и отображаются на белках фаговой оболочки и сравниваются с интересующим белком. UbV, которые демонстрируют благоприятные связывающие взаимодействия с целевым белком, сохраняются, в то время как плохие связующие смываются и удаляются из библиотечного пула. Сохраненные UbV, которые присоединены к фаговой частице, содержащей соответствующий фагемид UbV, элюируют, усиливают и концентрируют таким образом, чтобы их можно было панорамировать против того же целевого белка в другом раунде фагового дисплея. Как правило, выполняется до пяти раундов отображения фагов, во время которых сильное давление отбора накладывается на UbV, которые связываются слабо и / или беспорядочно, так что те, у кого более высокое сродство, концентрируются и обогащаются. В конечном счете, UbV, которые демонстрируют более высокую специфичность и /или сродство к целевому белку, чем их аналоги дикого типа, выделяются и могут быть охарактеризованы с помощью дальнейших экспериментов.
Introduction
Понимание молекулярных деталей белково-белковых взаимодействий имеет решающее значение для определения механизмов сигнальной трансдукции биологических процессов, особенно тех, которые способствуют клинически важным заболеваниям. В последние годы фаговой дисплей использовался в качестве практичного и доступного метода выделения белков/пептидов с значительно улучшенным связыванием с желаемым целевым белком1,2,3,4, который, в свою очередь, может быть использован в качестве внутриклеточных зондов белково-белковых взаимодействий.
Убиквитинирование представляет собой каскад ферментативной активности (активирующий фермент E1 → конъюгирующий фермент E2 → лигазы E3), которые ковалентно конъюгируют убиквитин (Ub) с белковыми субстратами, чтобы нацелить их на деградацию или опосредовать изменения клеточной сигнализации. Кроме того, деубиквитиназы катализируют удаление убиквитина из белков. Таким образом, в клетках существуют тысячи Ub-зависимых белково-белковых взаимодействий, подавляющее большинство из которых распознают общую поверхность с низким сродством, но высокой специфичностью, чтобы обеспечить слабые взаимодействия через большие и разнообразные поверхности.
Ernst et al. ввели мутации в известные области связывания Ub, чтобы увидеть, могут ли они повысить сродство связывания с интересующим белком, сохраняя при этом высокую селективность5. Была разработана комбинаторная библиотека из более чем 10 миллиардов (7,5 x 1010) вариантов Ub (UbV) с мутациями в положениях по всей поверхности Ub, которые опосредуют известные взаимодействия Ub-белка. Эта библиотека состояла из фагемидов, которые экспрессируют белок оболочки бактериофага PIII M13, слитый с диверсифицированными UbV. Таким образом, отдельные UbV могут отображаться на поверхности фага через белок оболочки при экспрессии. Во время процесса селекции фаг, который отображает UbV со значительными связывающими взаимодействиями с целевым белком, будет сохранен и обогащен в последующих раундах отображения фагов, тогда как фаг, отображающий UbV, которые плохо связываются с целевым белком, смывается и удаляется из фагового пула. Сохраненные фаговые частицы содержат фагемид, соответствующий их отображаемому UbV, что позволяет секвенировать их и дополнительно характеризовать после выделения.
Используя эту стратегию белковой инженерии, ингибиторы UbV были разработаны для человеческих деубиквитиназ5 и вирусных протеаз6. Важно отметить, что мы создали ингибирующие UbV для человеческих лигазов E3 семейства HECT путем захвата сайта связывания E2 и активации UbV, которые занимают Ub-связывающий экзозит на домене HECT7. Мы также можем ингибировать мономерные RING-семейства E3s, нацеливаясь на сайт связывания E2 и индуцируя димеризацию UbV для активации гомодимерного RING E3s8. Для многосубъединичных RING E3s UbV могут достигать ингибирования путем нацеливания на субъединицу RING (например, для комплекса APC/C9) или нарушения образования комплекса (например, для SCF E3s10). В совокупности UbV могут быть использованы для систематического опроса белково-белковых взаимодействий в системе Ub-протеасом (UPS), чтобы мы могли лучше расшифровать биохимические механизмы ферментов UPS, а также идентифицировать и проверить функциональные сайты для терапевтического вмешательства.
Следующий протокол описывает, как использовать ранее сгенерированную фаговую отображаемую библиотеку UbV для нацеливания на интересующий белок и как обогатить связующие вещества UbV, которые взаимодействуют с целевым белком посредством последовательных раундов отображения фагов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Как упоминалось на этапе 2.1 (получение белка), для оценки концентрации белка могут быть использованы различные методы, и каждый из них будет иметь уникальные преимущества и недостатки, основанные на конкретном целевом белке, используемом для отображения фагов. Источник подробных описа?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Технология убиквитинового варианта была разработана в лаборатории доктора Сачдева Сидху (Университет Торонто). WZ в настоящее время является глобальным ученым CIFAR Azrieli в программе «Люди и микробиом». Это исследование финансировалось грантами NSERC Discovery, присужденными WZ (RGPIN-2019-05721).
Materials
| Axygen Mini Tube System (0.65 mL, sterile, 96/Rack, 10 Racks/pack) | Fisher Scientific | 14-222-198 | Culturing phage outputs after phage display. |
| BD Difco Dehydrated Culture Media: LB Broth, Miller (Luria-Bertani) | Fisher Scientific | DF0446-17-3 | Preparing plates for titering. |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V | BioShop Canada | ALB001 | Buffer component. |
| Carbenicillin disodium salt 89.0-100.5% anhydrous | Millipore-Sigma | C1389-5G | Culturing phagemid-infected cells. |
| Compact Digital Microplate Shaker | Fisher Scientific | 11-676-337 | Shaking plates during incubation with the phage library. |
| Corning Microplate Aluminum Sealing Tape | Fisher Scientific | 07-200-684 | Sealing phage glycerol stocks. |
| Dehydrated Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | Preparing plates for titering. |
| DS-11 Spectrophotometer/Fluorometer | DeNovix | DS-11 FX+ | Protein concentration measurement. |
| Greiner Bio-One CellStar 96-Well, Non-Treated, U-Shaped-Bottom Microplate | Fisher Scientific | 7000133 | Storing phage glycerol stocks. |
| Hydrochloric Acid | Fisher Scientific | A144-500 | Phage elution. |
| Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R Chemically Competent E. coli | Fisher Scientific | C854003 | Bacterial strain for phage infection. |
| Kanamycin Sulfate | Fisher Scientific | AAJ1792406 | Culturing M13K07 helper phage-infected cells. |
| M13KO7 Helper Phage | New England Biolabs | N0315S | Permit phagemid packing and secretion. |
| MaxQ 4000 Benchtop Orbital Shaker | Fisher Scientific | 11-676-076 | Bacterial cell culture. |
| Nunc MaxiSorp 96 well microplate, flat bottom | Life Technologies | 44-2404-21 | Immobilizing proteins. |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) 10X Solution | Fisher Scientific | BP3994 | Buffer component/phage resuspension medium. |
| Polyester Films for ELISA and Incubation | VWR | 60941-120 | Covering the microplates during incubation. |
| Polyethylene Glycol 8000 (PEG) | Fisher Scientific | BP233-1 | Phage precipitation. |
| Sodium chloride | Millipore-Sigma | S3014 | Phage precipitation. |
| Sterile Plastic Culture Tubes: Translucent Polypropylene | Fisher Scientific | 14-956-1D | Culturing phage inputs. |
| Tetracycline Hydrochloride | Fisher Scientific | BP912-100 | Culturing E. coli OmniMax cells. |
| Tris Base | Fisher Scientific | BP1525 | Neutralizing eluted phage solution. |
| Tryptone Powder | Fisher Scientific | BP1421-2 | Cell growth media component. |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337500 | Buffer component. |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | BP1422-2 | Cell growth media component. |
References
- Karlsson, O. A., et al. Design of a PDZbody, a bivalent binder of the E6 protein from human papillomavirus. Scientific Reports. 5 (1), 9382 (2015).
- Veggiani, G., et al. Engineered SH2 domains with tailored specificities and enhanced affinities for phosphoproteome analysis. Protein Science. 28 (2), 403-413 (2019).
- Kaneko, T., et al. Superbinder SH2 domains act as antagonists of cell signaling. Science Signaling. 5 (243), (2012).
- Wiechmann, S., et al. Site-specific inhibition of the small ubiquitin-like modifier (SUMO)-conjugating enzyme Ubc9 selectively impairs SUMO chain formation. Journal of Biological Chemistry. 292 (37), 15340-15351 (2017).
- Ernst, A., et al. A strategy for modulation of enzymes in the ubiquitin system. Science. 339 (6119), 590-595 (2013).
- Zhang, W., et al. Potent and selective inhibition of pathogenic viruses by engineered ubiquitin variants. PLOS Pathogens. 13 (5), 1006372 (2017).
- Zhang, W., et al. System-wide modulation of HECT E3 ligases with selective ubiquitin variant probes. Molecular Cell. 62 (1), 121-136 (2016).
- Gabrielsen, M., et al. A general strategy for discovery of inhibitors and activators of RING and U-box E3 ligases with ubiquitin variants. Molecular Cell. 68 (2), 456-470 (2017).
- Brown, N. G., et al. Dual RING E3 architectures regulate multiubiquitination and ubiquitin chain elongation by APC/C. Cell. 165 (6), 1440-1453 (2016).
- Gorelik, M., et al. Inhibition of SCF ubiquitin ligases by engineered ubiquitin variants that target the Cul1 binding site on the Skp1-F-box interface. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (13), 3527-3532 (2016).
- Goldring, J. P. D. Protein quantification methods to determine protein concentration prior to electrophoresis. Protein Electrophoresis. 869, 29-35 (2012).
- Zhang, W., Sidhu, S. S. Generating intracellular modulators of E3 ligases and deubiquitinases from phage-displayed ubiquitin variant libraries. The Ubiquitin Proteasome System: Methods and Protocols. 1844, 101-119 (2018).
- Sheehan, J., Marasco, W. A. Phage and yeast display. Microbiology Spectrum. 3 (1), 1-17 (2015).
- Lowman, H. B., Wells, J. A. Monovalent phage display: A method for selecting variant proteins from random libraries. Methods. 3 (3), 205-216 (1991).
- Lowman, H. B., Bass, S. H., Simpson, N., Wells, J. A. Selecting high-affinity binding proteins by monovalent phage display. 생화학. 30 (45), 1-7 (1991).
- Beaber, J. W., Tam, E. M., Lao, L. S., Rondon, I. J. A new helper phage for improved monovalent display of Fab molecules. Journal of Immunological Methods. 376 (1-2), 46-54 (2012).
- Galán, A., et al. Library-based display technologies: where do we stand. Molecular BioSystems. 12 (8), 2342-2358 (2016).
- Huang, S., et al. Ribosome display and selection of single-chain variable fragments effectively inhibit growth and progression of microspheres in vitro and in vivo. Cancer Science. 109 (5), 1503-1512 (2018).
- Yamaguchi, J., et al. cDNA display: a novel screening method for functional disulfide-rich peptides by solid-phase synthesis and stabilization of mRNA-protein fusions. Nucleic Acids Research. 37 (16), 1-13 (2009).
- Mochizuki, Y., Kumachi, S., Nishigaki, K., Nemoto, N. Increasing the library size in cDNA display by optimizing purification procedures. Biological Procedures Online. 15 (1), 1-5 (2013).
- Odegrip, R., et al. CIS display: In vitro selection of peptides from libraries of protein-DNA complexes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (9), 2806-2810 (2004).
- Reiersen, H., et al. Covalent antibody display–an in vitro antibody-DNA library selection system. Nucleic Acids Research. 33 (1), 1-9 (2005).
- Houlihan, G., Gatti-Lafranconi, P., Lowe, D., Hollfelder, F. Directed evolution of anti-HER2 DARPins by SNAP display reveals stability/function trade-offs in the selection process. Protein Engineering Design and Selection. 28 (9), 269-279 (2015).
- Zhang, W., et al. Generation and validation of intracellular ubiquitin variant inhibitors for USP7 and USP10. Journal of Molecular Biology. 429 (22), 3546-3560 (2017).
- Teyra, J., et al. Structural and functional characterization of ubiquitin variant inhibitors of USP15. Structure. 27 (4), 590-605 (2019).
