Hier presenteren we een protocol om hoogwaardige kernen uit bevroren muizennieren te isoleren die de representatie van medullaire nierceltypen verbeteren en de genexpressieartefacten van enzymatische weefseldissociatie vermijden.
De nieren reguleren diverse biologische processen zoals water, elektrolyt en zuur-base homeostase. Fysiologische functies van de nier worden uitgevoerd door meerdere celtypen gerangschikt in een complexe architectuur over de corticomedullaire as van het orgaan. Recente ontwikkelingen in single-cell transcriptomics hebben het begrip van celtype-specifieke genexpressie in nierfysiologie en ziekte versneld. Op enzymen gebaseerde weefseldissociatieprotocollen, die vaak worden gebruikt voor eencellige RNA-sequencing (scRNA-seq), vereisen echter meestal vers (niet-gearchiveerd) weefsel, introduceren transcriptionele stressreacties en bevorderen de selectie van overvloedige celtypen van de nierschors, wat resulteert in een ondervertegenwoordiging van cellen van de medulla.
Hier presenteren we een protocol dat deze problemen voorkomt. Het protocol is gebaseerd op kernisolatie bij 4 °C uit bevroren nierweefsel. Kernen worden geïsoleerd uit een centraal stuk van de muizennier dat bestaat uit de cortex, de buitenste medulla en de binnenste medulla. Dit vermindert de oververtegenwoordiging van corticale cellen die typisch zijn voor hele niermonsters ten behoeve van medullaire cellen, zodat gegevens de gehele corticomedullaire as met voldoende overvloed weergeven. Het protocol is eenvoudig, snel en aanpasbaar en biedt een stap in de richting van de standaardisatie van single-nuclei transcriptomics in nieronderzoek.
Nieren vertonen een zeer complexe weefselarchitectuur. Ze bestaan uit functioneel en anatomisch verschillende segmenten langs een corticomedullaire as en bemiddelen biologische functies, zoals regulatie van extracellulair vloeistofvolume, elektrolytenbalans of zuur-base homeostase1.
Vooruitgang in single-cell transcriptomics heeft de diepgaande karakterisering van complexe weefsels mogelijk gemaakt en het begrip van segment- en celtypespecifieke genexpressie in nierfysiologie, ontwikkeling en ziekte versneld 2,3,4.
De op enzymen gebaseerde dissociatieprotocollen die vaak worden gebruikt voor scRNA-seq vertonen echter verschillende nadelen en beperkingen. Afhankelijk van het protocol genereren ze transcriptionele stressreacties en weefseldissociatiebias naar gemakkelijker te dissociëren corticale celtypen 5,6. Hoewel protocollen met behulp van koud-actieve proteasen voor embryonale nieren in staat zijn om stressgerelateerde transcriptionele veranderingen te verminderen, slagen ze er niet in om de dissociatiebias ten opzichte van corticale cellen te overwinnen en zijn ze mogelijk niet gemakkelijk aan te passen aan verschillende soorten zieke nierweefsels7. Bovendien zijn eencellige benaderingen niet gemakkelijk compatibel met ingevroren weefselmonsters, waardoor de toepassing ervan meestal wordt beperkt tot niet-gearchiveerd, vers weefsel, waardoor de weefselverzameling een beperkende factor6 wordt.
Single-nuclei RNA sequencing (snRNA-seq) kan deze beperkingen omzeilen 8,9. Hier presenteren we een protocol voor kernisolatie uit een centraal plakje bevroren volwassen muizennierweefsel (figuur 1)10. Ons protocol is eenvoudig en biedt een gestandaardiseerde aanpak om RNA-sequencingbibliotheken te verkrijgen met een evenwichtige weergave van verschillende nierceltypen voor experimentele modellen die geen sterke regionale weefselveranderingen met zich meebrengen. In het laatste geval kan ons protocol ook worden uitgevoerd met hele nieren.
Single-cell transcriptomics bevorderen het begrip van celtype-specifieke genexpressie in nierfysiologie en ziekte. Hier hebben we een eenvoudige en reproduceerbare methode geleverd om hoogwaardige enkele kernen uit bevroren nierweefsel van muizen te isoleren voor snRNA-seq op een gestandaardiseerde manier.
Voor snRNA-seq is het van cruciaal belang om hoogwaardige kernen te gebruiken als input voor het genereren van bibliotheken en om RNA-afbraak tijdens weefselverwerking te voorkomen. Daarom is de incubatie van weefselstukken in RNA-stabilisatieoplossing onmiddellijk na dissectie essentieel om cellulair RNA te beschermen en te stabiliseren en maakt het mogelijk om monsters voor onbepaalde tijd op te slaan bij – 80 ° C. Bij het toepassen van dit protocol op bevroren weefsel zonder behandeling met RNA-stabilisatieoplossing, zoals archiefmateriaal, is een proefrun vereist en moet de RNA-kwaliteit worden beoordeeld, omdat we een significant verlies van RNA-integriteit hebben waargenomen in snap-bevroren weefsel zonder voorafgaande incubatie in RNA-stabilisatieoplossing.
Over het algemeen is een juiste monsterbehandeling cruciaal voor het maximaliseren van het herstel van intacte, enkele kernen. Alle resuspensiestappen moeten worden uitgevoerd door zorgvuldig te pipetteren om schuifspanning en fysieke schade te voorkomen. Buffers voor de uiteindelijke kernresuspensie en kernsortering moeten BSA bevatten om kernverlies en aggregatie te voorkomen.
Buffervolumes in dit protocol zijn geoptimaliseerd voor zeer kleine weefselmonsters (~ 15 mg). Het is van cruciaal belang om te zorgen voor volledige cellysis en voldoende wassen om hoogwaardige suspensies te genereren. Grotere weefselblokken of hele niermonsters zullen resulteren in overmatige kernconcentraties die leiden tot klontering en aggregatie, hoge overvloed aan omgevings-RNA en algehele slechte suspensiekwaliteit. Als grotere monsters of andere weefsels worden verwerkt, wordt het ten zeerste aanbevolen om proefdraaien uit te voeren om optimale buffervolumes te bepalen voor minimale omgevings-RNA-niveaus. De kwaliteit en concentraties van kernen en RNA moeten zorgvuldig worden onderzocht, omdat overbelasting resulteert in algehele slechte prestaties.
Bovendien beïnvloeden grote hoeveelheden celpuin, waardoor hoge niveaus van omgevings-RNA die niet geassocieerd zijn met enkele kernen, de sequencingresultaten negatief. Opheldering van de kernsuspensie door centrifugatie door middel van een sucrosekussen vermindert dit probleem tot op zekere hoogte, maar het kan ook leiden tot vertekening in de weergave van het celtype door tegenwicht te bieden aan dichte, kleine kernen die bijvoorbeeld aanwezig zijn in immuuncellen16. Als dit van belang is, moet de sucrosegradiënt worden weggelaten. Daarentegen vonden we dat flowcytometrie op basis van DAPI-kleuring van cruciaal belang was om de hoeveelheid celresten te verminderen om een hoogwaardige suspensie met één kern te produceren.
De isolatie van enkele kernen heeft aanzienlijke voordelen in vergelijking met eencellige benaderingen8. Het is compatibel met goed bevroren weefsel, waardoor de weefselverzameling flexibeler wordt en omzeilt de noodzaak van op enzymen gebaseerde weefseldissociatie, die transcriptionele stressreacties kan introduceren 6,17. Bovendien overwint het de dissociatiebias die de selectie van gemakkelijk dissocieerbare celtypen van de nierschors bevordert, wat kan leiden tot een ondervertegenwoordiging van medullaire celtypen in sommige op enzymen gebaseerde benaderingen 5,6,10.
Het gebruik van een centraal nierstuk in plaats van heel nierweefsel bespaart verder middelen en corrigeert voor de oververtegenwoordiging van overvloedige celtypen zoals eerder beschreven10. Afhankelijk van het onderzochte muismodel of fenotype kan het echter nuttig zijn om hele niermonsters te gebruiken in plaats van een enkele middelste plak. Hele niermonsters kunnen meer representatief zijn voor echte celverhoudingen of veranderingen die zich voordoen in de hele nier, terwijl een bijgesneden middelste schijf gunstig bleek voor medullaire fenotypen of wanneer het monstermateriaal beperkt was. Deze beslissing is daarom zeer gebruikersspecifiek en moet zorgvuldig worden overwogen.
The authors have nothing to disclose.
We danken het Scientific Genomics Platform van het Max Delbrück Center for Molecular Medicine in de Helmholtz Association, Berlijn voor de technische ondersteuning.
JL en KMSO werden ondersteund door de Duitse Onderzoeksstichting (DFG) Research Training Group GRK 2318 en door onderzoekseenheid FOR 2841. KMSO werd ondersteund door Collaborative Research Grant 1365. AB werd ondersteund door financiering van de Gottfried Wilhelm Leibniz-prijs van de DFG toegekend aan NR.
Cell sorter | – | – | For fluorescence-activated cell sorting (FACS); e.g. BD FACSAria Cell Sorter. |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf | 5811000015 | |
Countess Cell Counting Chamber Slides | Invitrogen | C10228 | |
Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | AMQAF1000 | Needs to contain DAPI light cube to count nuclei. Alternatively, nuclei can be counted manually under fluorescence microscope. |
4′,6-Diamidino-2-phenyl-indol-dihydrochlorid (DAPI) | Biotrend | 40043/b | Stock solution prepared with a concentration of 100 µM. Used for nuclei staining in a final concentration of 2 µM. |
D(+)-Sucrose ≥99.9%, ultrapure DNAse-, RNAse-free | VWR | 0335-500G | |
DNA LoBind Microcentrifuge Tubes (1.5 mL) | Eppendorf | 22431021 | |
Ethanol, 70 % | – | – | |
FACS tubes | pluriSelect | 43-10100-46 | |
KIMBLE Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma-Aldrich | D8938-1SET | |
Minisart Syringe Filters 0.2 µm | Sartorius | 16534-GUK | |
Nuclease-free Water | Invitrogen | AM9937 | |
Nuclei EZ Prep Nuclei Isolation Kit | Sigma-Aldrich | NUC-101 | Nuclei EZ Lysis Buffer (Product No. N3408) needed for buffer preparation. |
PBS (Phosphate-Buffered Saline) 1X without calcium or magnesium | Corning | 21-040-CV | |
Petri dishes, polystyrene 60 mm | Sigma-Aldrich | P5481 | |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) with 10% Bovine Albumin | Sigma-Aldrich | SRE0036 | |
pluriStrainer Mini 100 µm | pluriSelect | 43-10100-46 | |
pluriStrainer Mini 20 µm | pluriSelect | 43-10020-40 | |
pluriStrainer Mini 40 µm | pluriSelect | 43-10040-40 | |
Polystyrene Centrifuge Tube (15 mL) | Falcon | 352099 | |
Razor blades | – | – | |
RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | EO0384 | |
Ribonucleoside-vanadyl complex | New England Biolabs | S1402S | Follow manufacturer's instructions (https://international.neb.com/products/s1402-ribonucleoside-vanadyl-complex#Product%20Information). Upon use the 200 mM stock solution is reconstituted to a green-black clear solution by incubating at 65 °C. |
RNAlater Stabilization Solution | Invitrogen | AM7020 | |
RNase AWAY | Fisher Scientific | 11952385 |