Caenorhabditis elegans에서 도파민인체학 뉴런 형태 학적 변경 및 변성의 수준을 정량화

파킨슨 병 (PD)은 전 세계적으로 최대 1,000 만 명의 개인에 영향을 미치는 점점 더 흔한 신경 퇴행성^{질환입니다.} 남성과 노인은 PD 개발을 위한 고위험에; 질병에 대한 발병의 평균 연령은 60 년이며, PD 부각은 일반 인구에서 0.3 %의 부각에서 80 세 이상 개인에서 3 %로 올라갑니다^1,2. PD 병리학의 세부 사항은 완전히 이해되지 않지만,이 진보적 인 장애는 중뇌의 실질적인 니그라 영역에서 도파민 간 뉴런의 손실을 포함한다. 이 신경 손실의 가설된 기계장치는 미토콘드리아 기능 장애, 산화 스트레스 및 염증^2를포함한다. 질병의 원인과 위험 요소는 여전히 탐구되고 있지만 환경 및 유전 적 요인^1의조합을 포함합니다. 예를 들어, 연구는 평생 농약 사용과 PD 사이의 긍정적 인 연관성뿐만 아니라 가족 PD^1,3에대한 유전 적 감수성을 발견했다.

원래 신경생물학 연구^4를위해 부분적으로 개발된 C. elegans 모델 시스템은 생체 내에서 도파민성 뉴런 손실을 평가하는 데 적합합니다. Nass와 동료들은 도파민성 신경 변성^5를위해 C. 엘레건의 사용을 개척했으며, 많은 그룹은 이후 PD및 도파민 기능장애^{6,7,8,9,10, 11,12,13,14,15,16,}17에 대한 성공적인 모델로 웜을^{채택했습니다. ,18,19,20}. C. elegans는 생물학의 그밖 지역에 대한 그 같은 대중적인 모형 유기체인 것과 같은 이유의 많은 을 위한 좋은 신경 퇴행성 질병 모형입니다; 그들의 투명성은 세포 과정의 생체 내 연구를 허용하고, 벌레의 유전 조작은 상대적으로 빠르고 쉽고, 약 3 일의 짧은 세대 시간을 가지고 있으며,^21을유지하기 쉽습니다. 대부분의 PD 웜 모델은 연령 기반 모델, 화학 모델 및 유전 모델의 세 가지 범주 중 하나에 속합니다. 벌레의 인구를 동기화하는 기능은 PD^22와같은 노화와 관련된 신경 퇴행성 질환의 연령 기반 모델에 대한 연령 관련 신경 변성의 연구를 허용합니다. PD와 같은 신경 결함을 유발하는 화학적 노출은 6-하이드록시도파민(6-OHDA), 로테네톤, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라하이드로피리딘(MPTP)^22를포함한 다양한 화학물질을 사용하여 확립되었다. 벌레는 또한 PD의 유전 모델로 성공적으로 이용됩니다; 선택 신경 유전자 녹아웃균은 다양한 신경 퇴행성 질환^1,4를모델링 할 수 있습니다. PD 2, 17,^{23,24,25,26,27, 27,28에서}중요한 역할을 할 가능성이 있는 유전 적 및 환경 적 요인 또는 “유전자 환경 상호 작용”의 조합은 C. elegans를사용하여 여러 그룹에 의해 검사되었습니다. 마지막으로, 연령관련 도파민성 신경변성도^{관찰되었다 29,30.} 형광 화상 진찰에 있는 적당한 신경 형질 긴장을 사용하는 경우에, 이 PD 벌레 모형의 어느 것이 도파민성 신경 변성을 공부하기 위하여 이용될 수 있습니다.

신경 형태에 변화를 정량화하는 것은 신경 퇴행성 연구의 중요한 구성 요소입니다. C. elegans에서,많은 형광 기자 균주는 뉴런의 형태학적 변화와 손실을 시각화하는 데 사용되었습니다. 신경 화상 진찰에 적합한 긴장은 세포 특정 프로모터와 관련되었던 형광 단백질을 특징으로 합니다. 도파민성 신경변성 애사에 대해, 저희 실험실은 dat-1 유전자에 녹색 형광 단백질(GFP) 태그를 가진 BY200 [vtIs1(dat-1p:GFP,rol-6)] 균주를 사용했으며, 도파민성 뉴런으로 표현되었다. BY200의 롤러 표현형은 침투가 매우 낮으며 거의 관찰되지 않습니다. 화상 진찰의 이 모형을 위해 이용된 그밖 일반적인 긴장은 BY250[dat-1p:::GFP]를 포함합니다, BY273 [baEx18[dat-1p:::GFP+dat-1p::WT α-syn]], BZ555 [egIs1[dat-1p:::GFP]], 그리고 특정 노동계의 요청에 따라 Caenorhabditis 유전학 센터 (CGC)에서 사용할 수있는 여러 가지 다른^사람,21,29 . 이 긴장은 전형적으로 도파민제 뉴런의 모든 3개의 클래스의 시각화를 허용합니다: 세팔릭 (CEP), 전방 deirid (ADE), 및 포스트 데이리드 (PDE) 뉴런. C. 엘레간은 알파 시뉴클레인 단백질을 자연적으로 발현하지 는 않지만 BY273과 같은 균주는 이를 표현하도록 설계되었습니다. 그러나, 우리가 제시하는 득점 시스템은 알파 synuclein을 표현하지 않는 BY200을 사용하여 개발되었으며, 사용하기 전에 그 변형 (또는 다른 새로운 변형)으로 검증될 필요가 있음을 주목합니다. 추가 도파민성 뉴런은 남성에 존재하지만 남성은 일반적으로 C. elegans 인구의 <1 %를 구성하기 때문에 거의 고려되지 않습니다. 여기서, 우리는 C. elegans의머리 부위에서 발견되는 4개의 CEP 도파민성 뉴런에 초점을 맞추고 있습니다. 뉴런의이 세트는 쉽게 형광 현미경 검사의 밑에 위치하고, 헤르마크로디테와 남성 벌레 둘 다에 존재하고, 전형적으로 자동 형광의 그밖 지역과 겹치지 않으며, 일반적으로 벌레 연구 결과에서 보고됩니다. 특히, 이러한 뉴런은 골수화되지 않지만 CEP 등색 (CEPD) 뉴런은 CEP 복부 신경세포가 아닌 의사 류경상구체 유체에 직접 노출됩니다. CEP 수상라이트의 건강한 세트는 일반적으로 상대적으로 직선, 중단없는 선으로 표시됩니다. 퇴화 된 수상자는 점막의 라인을 따라 결점이라고 불리는 뚜렷한 점을 포함하여 부정과 손상의 징후의 조합을 표시 할 수 있으며, 수상자의 라인에서 파손. 다양한 수준의 변성에서 CEP 뉴런의 예는 도 1에서볼 수 있다.

도파민성 신경변성은 C. elegans 실험실의 증가에 의해 연구되고 있지만, 도파민성 뉴런 손상을 정량화하는 분석 방법에 큰 변화가 있었다^{29,31,32,33,34.} 많은 출판 된 연구는 일반적인 또는 야생 형 뉴런^31,32대 퇴행성 의 바이너리 채점 시스템을 가진 CEP 소마의 존재 또는 부재에 보고했다. 이러한 점수 매기기 방법은 신경 변성을 유도하는 특정 스트레스를 식별할 수 있지만 더 미묘한 신경 손상의 진행의 세부 사항을 정량화하거나 독특한 화학 물질 이나 다른 변수에 의해 유도 된 신경 변성 사이의 차이를 쉽게 감지 할 수 없습니다. 추가적으로, 세포 바디에 집중된 채점 시스템은 손상의 더 적게 가혹한 수준에 또는 원점과 같은 세포의 단지 부분에 영향을 미치는 신경 손상에 민감하지 않을 수 있습니다. 원원자는 화학 스트레스에 대한 응답으로 일관되게 검출 가능한 형태학적 변화의 가장 큰 범위를 가지고 있는 것으로 나타나기 때문에, 우리는 우리의 분석의 기초로 선택했습니다. 여기서 제시하는 채점 시스템은 이전에 당사의 실험실^29,33에서사용되었던 원회성 형태기반 멀티포인트 스케일에서 수정됩니다. 이 시스템은 이러한 5점 및 6점 척도를 7점 척도로 확장하여 노인 성수기의 꼬임 수가 증가하고 심각한 손상과 완전한 민원 손실을 구별하는 등 연령과 관련된 형태학적 변화를 고려합니다. 이 점수 시스템을 도입하는 목적은 신경 손상의 모든 수준에서 신경 변성의 포괄적 인 그림을 캡처하고 C. elegan dopaminergic 신경 변성 연구에 걸쳐 일관성을 지원하는 보편적 인 시스템을 제공하는 것입니다. 득점은 본질적으로 주관적이기 때문에 개인 득점 사이의 일관성을 극대화하고 수동 블라인드 또는 자동 블라인드 프로그램^(35)을사용하여 이미지의 정체성에 점수를 맹목적으로 하는 것이 중요합니다. 일관성을 향상시키기 위해 일련의 교육 이미지를 제시하고 JoVE의 비디오 기능을 활용하여 점수 매기기 시스템을 자세히 보여줍니다. 두 가지 모두 자동 블라인드 득점을 허용하고 득점자가 이미지의 하위 집합을 다시 득점하여 점수 일관성을 정량화할 수 있는 시스템을 사용하는 것이 좋습니다. 이것은 여러 과학자의 데이터를 결합하거나 비교하거나 점수를 새로 훈련할 때 특히 중요합니다.