חיסון חופשי של מוחות עכבר
Summary
פרוטוקול זה מתאר גישה יעילה וניתנת לשחזור למחקרים היסתולוגיים במוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה.
Abstract
הכתמת אימונוהיסטוכימית של מוחות עכברים היא טכניקה שגרתית הנפוצה במדעי המוח כדי לחקור מנגנונים מרכזיים שבבקרה את ויסות חילוף החומרים של האנרגיה ותהליכים נוירוביולוגיים אחרים. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של תוצאות היסטולוגיה במוח עשויות להשתנות בין מעבדות. עבור כל ניסוי מכתים, יש צורך לייעל את ההליכים העיקריים המבוססים על הבדלים בין מינים, רקמות, חלבונים ממוקדים ותנאי העבודה של ריאגנטים. מאמר זה מדגים זרימת עבודה אמינה בפירוט, כולל זלוף תוך-בתחום, חתך מוחי, חיסון צף חופשי, הרכבת רקמות והדמיה, אשר ניתן לעקוב בקלות על ידי חוקרים בתחום זה.
כמו כן נדונים כיצד לשנות נהלים אלה כדי לספק את הצרכים האישיים של החוקרים. כדי להמחיש את האמינות והיעילות של פרוטוקול זה, רשתות פרינורונאליות הוכתמו עם ביוטין תווית ויסטריה florbunda agglutinin (WFA) ו ארגינין וזופרסין (AVP) עם נוגדן אנטי AVP במוח העכבר. לבסוף, הפרטים הקריטיים עבור ההליך כולו טופלו, ואת היתרונות של פרוטוקול זה לעומת אלה של פרוטוקולים אחרים. יחד, מאמר זה מציג פרוטוקול ממוטב לחיסון חופשי של רקמת מוח העכבר. בעקבות פרוטוקול זה מקל על מדענים זוטרים ובכירים כאחד לשפר את האיכות, האמינות והשחזור של מחקרים חיסוניים.
Introduction
השכיחות של השמנת יתר ותחלואה נלווית הגיעה לרמות מגיפה, גרימת נטל חברתי-כלכלי עצום1,2. מודלים עכבר שונים פותחו כדי להבין טוב יותר את התהליכים הביולוגיים האחראים להשמנת יתר3,4. מכיוון שמנגנונים מרכזיים חשובים לוויסות הומאוסטזיס אנרגטי במודלים אלה של בעלי חיים, מחקרים נוירואנטומיים של מוחות עכברים הפכו לטכניקה הכרחית בתחום זה. עם זאת, האיכות, האמינות והשחזור של טכניקות היסטולוגיה במוח משתנות במידה ניכרת בין מעבדות ואפילו חוקרים באותה מעבדה מסיבות שונות (למשל, נוגדנים, רקמות, טיפולים, מינים, מטרות מחקר). לכן, יש צורך לקבוע פרוטוקול כללי למחקרים היסתולוגיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך מוחי, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. בינתיים, מתחילים יכולים ללמוד במהירות, לשלוט ולהתאים פרוטוקול זה כדי לספק את הצרכים האישיים שלהם.
כתמים אימונוהיסטוכימיים היא שיטה מבוססת כי נעשה שימוש נרחב כדי לדמיין סוגי תאים ספציפיים, mRNAs, וחלבונים במגוון רחב של רקמות (למשל, המוח ורקמות היקפיות)5,6. ליתר דיוק, אנטיגן של עניין יכול להיות מתויג על ידי נוגדן ראשוני מסוים נוגדן משני מתאים מקושר אנזים (למשל, אימונוהיסטוכימיה כרומוגנית) או צבע פלואורסצנטי (פלואורסצין איזוטיוצינט)6. כדוגמה לתועלת של טכניקות אלה, β-אנדורפין [פפטיד אחד מקודד על ידי פרו-אופיומלאנוקורטין (POMC)] ו- c-fos (סמן של פעילות עצבית) הוכתמו בגרעין הארקואט. מחיקה של טריפטופן הידרוקסילאז 2 (אנזים אינטגרלי לסינתזת סרוטונין) בגרעין raphe גבית תורסאלי הוכח להקטין ביטוי c-fos נוירונים POMC בגרעין arcuate7. בנוסף, ההפצה של mRNA קולטן ויטמין D מופה במוח העכבר באמצעות הכלאה במקום (RNAscope)8. מאמר זה מציג שיטה אמינה ויעילה עם זרימת עבודה שלב אחר שלב עבור חיסון צף חופשי, במטרה לשפר את האיכות ואת הרבייה של מחקרים היסטולוגיים של מוח העכבר.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מספק שיטה מבוססת למחקרים נוירואנטומיים של מוח העכבר, כולל זלוף, חתך רקמות, חיסונים צפים חופשיים, הרכבת רקמות והדמיה. עם זאת, יש למטב כמה פרטים מרכזיים החיוניים לתוצאות עקביות ואמינות.
איכות הזלוף היא קריטית להכתמת מוצלחות. כתמי תוצאות עשויים להיות מושפעים אם הדם …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
החוקרים נתמכו על ידי מענקים מה- NIH (K01DK119471 ל- CW; P01DK113954, R01DK115761, R01DK117281, R01DK125480, ו- R01DK120858 ל- YX), USDA / CRIS (51000-064-01S ל- YX) ומלגת פוסט-דוקטורט של איגוד הלב האמריקאי (#829565) ל- LT.
Materials
| Alexa Flour 594 donkey anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen | A21207 | |
| 30% Sucrose | VWR | 470302 | 30 g Sucrose dissoved into 100 mL of PBS |
| Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | 10%, 25 °C, pH 6.8-7.2 |
| 1 mL Sub-Q Syringe | BD | 309597 | |
| 48 Well Cell Culture Plate | Corning | 3548 | |
| 6 Well Cell Culture Plate | Corning | 3516 | |
| Antifading mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Autoclavable plastic desiccator | Thermo Scientific Nalgene | 5315-0150 | |
| AVP antibody | Phoenix Pharmaceuticals | H-065-07 | |
| Cell Strainer | Corning | 431752 | |
| Cryoprotectant buffer | User preference | Not applicable | 20% glycerol, 30% ethylene glycol, and 50% PBS |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Leica DFC310FX microscope | Leica | Not applicable | |
| Microscope Slide Boxes (50-place) | VWR | Not applicable | |
| PBT | User preference | Not applicable | 2.5 mL of Triton X-100 dissolved into 1000 mL of PBS |
| Perfusion two automated Perfusion System | Leica | 39471005 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) 20x | VWR | VWRVE703-1L | 25 °C, pH 7.3-7.5, 1x composition:137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 9.8 mM Phosphate buffer |
| Slideing Microtome Microm HM450 | ThermoFisher | Microm HM450 | |
| Sodium Chloride | RICCA Chemical | 7220-32 | 0.9%, 25 °C, pH 7.4 |
| Streptavidin Protein, DyLight 488 | ThermoFisher | #21832 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 089k01921 | |
| WFA antibody | Sigma-Aldrich | L1516 | |
| Zeiss Axio Z1 Scanner | Zeiss | Not applicable | |
| Zen 3.1 software | scanner software |
References
- Must, A., et al. The Disease burden associated with overweight and obesity. Journal of the American Medical Association. 282 (16), 1523-1529 (1999).
- Apovian, C. M. Obesity: definition, comorbidities, causes, and burden. The American Journal of Managed Care. 22 (7), 176-185 (2016).
- Wong, S. K., Chin, K. Y., Suhaimi, F. H., Fairus, A., Ima-Nirwana, S. Animal models of metabolic syndrome: a review. Nutrition & Metabolism. 13 (1), 1-12 (2016).
- Kennedy, A. J., Ellacott, K. L., King, V. L., Hasty, A. H. Mouse models of the metabolic syndrome. Disease Models & Mechanisms. 3 (3-4), 156-166 (2010).
- Schacht, V., Kern, J. S. Basics of immunohistochemistry. The Journal of Investigative Dermatology. 135 (3), 1-4 (2015).
- Mepham, B. L., Britten, K. J. M., Jones, D. B., Wright, D. H. Immunostaining methods for frozen and paraffin sections. Lymphoproliferative Diseases. 15, 187-211 (1990).
- Liu, H., et al. TPH2 in the dorsal raphe nuclei regulates energy balance in a sex-dependent manner. Endocrinology. 162 (1), 1-16 (2021).
- Liu, H., et al. Defining vitamin D receptor expression in the brain using a novel VDR(Cre) mouse. Journal of Comparative Neurology. 529 (9), 2362-2375 (2020).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (65), e3564 (2012).
- Whittington, N. C., Wray, S. Suppression of red blood cell autofluorescence for immunocytochemistry on fixed embryonic mouse tissue. Current Protocols in Neuroscience. 81 (1), 2-28 (2017).
- Zeller, R. Fixation, embedding, and sectioning of tissues, embryos, and single cells. Current Protocols in Pharmacology. , (2001).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (162), e61622 (2020).
- He, Y., et al. A small potassium current in AgRP/NPY neurons regulates feeding behavior and energy metabolism. Cell Reports. 17 (7), 1807-1818 (2016).
- Xu, P., et al. Activation of serotonin 2C receptors in dopamine neurons inhibits binge-like eating in mice. Biololgical Psychiatry. 81 (9), 737-747 (2017).
