Messung der zeitlichen Entwicklung von nanoskaligen Materialien mit gestopptem Fluss und Kleinwinkel-Neutronenstreuung

Die Kleinwinkel-Neutronenstreuung (SANS) bietet eine einzigartige Möglichkeit, die Größe, Form, Wechselwirkung und Organisation verschiedener Materialien auf Längenskalen von ≈1 nm bis ≈100 nm ^1,2,3 zu messen. Neuere Instrumente, darunter VSANS-Instrumente (Very Small-Angle Neutron Scattering) mit fokussierenden Spiegeln, verschieben die Grenzen für die Messung noch größerer Längenskalen bis ≈1000 nm ^4,5. Im Allgemeinen bietet der einzigartige Streukontrast, der Neutronenstreumethoden innewohnt, mehrere Vorteile bei der Messung der zeitlichen Entwicklung von nanoskaligen Strukturen, wie z.B. der Aggregation von Komponenten in pharmazeutischen Formulierungen⁶, Vernetzungs- und Gelierungsreaktionen in Polymersystemen ^7,8, bei der Mesokristallisation von Membranproteinen^9,10, dem Abbau und der Entfaltung von Proteinen^11,12 und das Wachstum von Materialien auf Kieselsäurebasis^13,14,15. Der einzigartige Streukontrast macht zeitaufgelöste SANS (TR-SANS) zu einer nützlichen Ergänzung zu anderen Stopped-Flow-basierten Messungen.

Stopped-Flow-Mischmethoden werden häufig in der Kleinwinkel-Röntgenstreuung (SAXS)16,17,18,19,20,21, der Fluoreszenzspektroskopie 22,23,24,25,26 und der Lichtstreuung ^27,28,29,30 eingesetzt^{. 31,32} Experimente zur Untersuchung kinetischer Prozesse auf Millisekunden-Zeitskalen. Ein wichtiger Unterschied zwischen SANS und SAXS besteht darin, dass die Neutronenstreuung eine zerstörungsfreie Charakterisierungstechnik ist und SANS als solche verwendet werden kann, um dieselbe Probe stunden- oder sogar tagelang zu messen, ohne dass ionisierende Strahlung die Probe schädigt, was bei Röntgenstreuexperimenten mit höherem Fluss auftreten kann³³. Da wiederholte SANS-Messungen die chemische Struktur des Sondenmoleküls oder der Probe nicht verändern, kann die Zeitentwicklung ohne Effekte von z. B. Photobleichung untersucht werden, die kinetische Messungen erschweren können, die auf Fluoreszenz basieren^23,24. Darüber hinaus können mit SANS hochkonzentrierte und optisch undurchsichtige Proben gemessen werden, die mit lichtbasierten Techniken wie dynamischer Lichtstreuung oft nur schwer zu charakterisieren sind.

SANS liefert nicht nur strukturelle Informationen auf der Nanoskala, sondern kann auch verwendet werden, um die lokale Zusammensetzung dieser Strukturen durch die Variation des Längendichtekontrasts der Neutronenstreuung zu untersuchen. Die Streulängendichte (SLD) verschiedener Elemente variiert zufällig über das Periodensystem und variiert mit verschiedenen Isotopen desselben Elements. Ein häufig genutztes Beispiel sind Wasserstoff (¹H oder H) und Deuterium (²H oder D), die sehr unterschiedliche Neutronenstreulängen haben. Daher können wasserstoffreiche Materialien wie Tenside, Lipide, Proteine, RNA, DNA und andere Polymere mit SANS von deuterierten Lösungsmitteln unterschieden werden, ohne die physikalischen Eigenschaften des Systems wesentlich zu verändern. Es ist jedoch wichtig zu beachten, dass der H/D-Austausch die Dichte, die Wasserstoffbrückenbindung und die Phasenübergangstemperaturen in der Probe beeinflussen kann. Nichtsdestotrotz ist die einzigartige Empfindlichkeit von SANS gegenüber wasserstoffreichen Materialien besonders nützlich in der Forschung an weicher Materie, wo die interessierenden Proben in röntgenbasierten Techniken wie SAXS einen geringeren Streukontrast und ein geringeres Signal aufweisen. Die Isotopensubstitution macht SANS auch zu einem leistungsstarken Werkzeug für die Untersuchung der molekularen Austauschkinetik in wasserstoffreichen Materialien, indem einfach H-markierte und D-markierte Moleküle gemischt werden. Die Isotopensubstitution ist besonders nützlich in Systemen, in denen voluminöse Fluoreszenzfarbstoffe größer sind als die interessierenden Tensid- oder Lipidmoleküle und die Austauschkinetik beeinflussen können^34,35.

Zeitaufgelöste SANS-Messungen sind von Vorteil, da die gemessene Intensität eine Funktion von Zeit, Längenskala und SLD-Kontrast ist. Daher können TR-SANS-Experimente so konzipiert werden, dass sie die zeitabhängigen Änderungen der räumlichen Verteilungen und der Zusammensetzung der Proben untersuchen. Diese einzigartigen Vorteile von SANS haben zu wichtigen Erkenntnissen über kinetische Prozesse in vielen weichen Materialsystemen geführt, wie z.B. Tenside 36,37,38, Emulsionen 39,40,41, Lipide ^{34,42,43,44,45,46,47,48,49 50} und Polymere 51, 52, 53, 54, ^{55, 56}, ⁵⁷, ⁵⁸, ^{59, 60},^{61, 62}. Die meisten TR-SANS-Studien haben sich auf Zeitskalen von Minuten bis Stunden konzentriert. Viele kinetische Prozesse, die von Interesse sind, finden jedoch auf der zweiten Zeitskala statt und sind essentiell für das Verständnis der zugrunde liegenden Mechanismen. Um diese frühen Zeitpunkte zu erfassen, müssen die Lösungen schnell gemischt und in situ gemessen werden, wobei die Durchmischung mit der Datenerfassung während der gestoppten Lichtstreuung 27,28,29,30,31,32, Fluoreszenz 22,23,24,25,26 und Röntgenstrahlung ^{synchronisiert wird} 16,17,18,19,20,21 Experimente. Diese Arbeit beschreibt die Verwendung einer Probenumgebung, die darauf ausgelegt ist, mehrere flüssige Proben schnell zu mischen und die Mischung für TR-SANS-Messungen in eine Quarzglaszelle zu injizieren. Die Mischvorrichtung ist eine Adaption der kürzlich entwickelten KapillarrheoSANS-Vorrichtung⁶³ und verwendet mehrere Spritzenpumpen und Ventile, um die Probenmischung zu steuern und die Zellreinigung zu automatisieren. Durch den Anschluss von Spritzenpumpen an eine Reihe von Durchflusswahlventilen können mehrere Einlassströme wiederholt gemischt, gemessen, gespült und getrocknet werden, um TR-SANS-Messungen auf der Sekunden-Zeitskala zu erleichtern.

Das derzeitige Verfahren geht davon aus, dass die interessierenden Proben identifiziert und aufbereitet wurden. Wir konzentrieren uns auf den in situ Mischaufbau und Methoden zur Erfassung von TR-SANS-Daten. Neutronenstreudaten wurden mit dem VSANS-Instrument am NIST Center for Neutron Research (NCNR) gesammelt; Das Verfahren sollte jedoch auch auf andere SANS-Instrumente anwendbar sein. Leser, die daran interessiert sind, ähnliche Protokolle auf anderen SANS-Instrumenten zu implementieren, sollten sich mit den lokalen Instrumentenwissenschaftlern beraten, um die optimale Instrumentenkonfiguration zu bestimmen, um den Neutronenfluss auf der gewünschten Längenskala und Zeitskala zu maximieren, die für die interessierenden kinetischen Prozesse am relevantesten ist. Die hier vorgestellten Daten wurden unter Verwendung der Hochfluss-“Weißstrahl”-Konfiguration auf VSANS gesammelt, um die Neutronenzahl bei Verlust der räumlichen Auflösung^{zu maximieren 5}. Die Detektorschlitten wurden so positioniert, dass sie einen Bereich von Streuvektoren (q) von 0,005 Å-1 < q < 0,5 ^Å-1 abdecken, was Längenskalen von ≈130 nm bis ≈13 nm entspricht. Der Streuvektor ist definiert als q = 4π/λ sin (θ/2), wobei λ die Neutronenwellenlänge und θ der Streuwinkel ist.

Das für die TR-SANS-Messungen verwendete Mischgerät mit gestopptem Durchfluss besteht aus mehreren Pumpen, Spülspritzen, Probenspritzen, Durchflussselektoren sowie einem dynamischen Mischer, einer Probenzelle und einem Mischprobenbehälter, wie in Abbildung 1 dargestellt. Alle abgedichteten Flüssigkeitswege befinden sich in einem klimatisierten Gehäuse, das die Spritzen, Ventile, Verbindungsschläuche, den dynamischen Mischer und die Probenzellen umfasst. Ein programmierbares thermoelektrisches Klimagerät wird verwendet, um die Gehäusetemperatur im Bereich von 10 °C bis 50 °C innerhalb von ±1 °C zu regeln. Beachten Sie, dass ein Teil der Gehäuseisolierung entfernt wurde, um die funktionierenden Teile des Geräts zu zeigen. Das Hauptgehäuse des Mischgeräts befindet sich auf einem Translationstisch an der NG3 VSANS-Strahllinie am NCNR. Die Position des Gehäuses wird mit dem Translationstisch eingestellt, um die Probenzelle im Pfad des Neutronenstrahls zu positionieren (gelbe gestrichelte Linie).

Abbildung 1: Ein Beispielaufbau für die Kombination von Stopped-Flow-Mixing und Kleinwinkel-Neutronenstreumessungen an der VSANS-Beamline am NIST Center for Neutron Research. Der Aufbau besteht aus vier Spritzenpumpen, zwei Spritzen zum Spülen von Lösungsmitteln und zwei Spritzen zur Probeninjektion, vier Pumpenwahlventilen, zwei Mischerwahlventilen, einem dynamischen Mischer, einer Durchfluss-Quarzzelle und einem Mischprobenbehälter. Einfallende Neutronen werden an der gemischten Probe gestreut, die sich in der Probenzelle befindet. Ein isoliertes Gehäuse mit Quarzfenstern und einer thermoelektrischen Klimaanlage dient zur Steuerung der Probe und aller Geräte bei konstanter Temperatur. Die gelbe gestrichelte Linie zeigt den Strahlengang der Neutronen. Maßstabsleiste = 10 cm. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Das in Abbildung 1 dargestellte Gerät ist mit zwei Probenspritzen, zwei Spülspritzen und einer Probenzelle konfiguriert. Entsprechende Flussdiagramme für die verschiedenen Schritte des Protokolls sind in Abbildung 2 dargestellt. Die gewünschten Volumina der beiden unterschiedlichen Proben werden in den Mischer und die Probenzelle injiziert (Abbildung 2A). Sobald die Probenzelle gefüllt ist, werden das Einlassschaltventil (ISV) und das Auslassschaltventil (OSV) geschlossen, um die Probenzelle vom dynamischen Mischer zu isolieren und eine Rückdiffusion der Probe in die Zelle während der TR-SANS-Datenerfassung zu verhindern (Abbildung 2B). Vor dem dynamischen Mischer variiert der Verbindungsschlauch in der Länge von 10 cm bis 1 m und hat keinen Einfluss auf die Mischverzögerungszeit. Schlauchverbindungen zwischen dem dynamischen Mischer und der Probenzelle wirken sich jedoch auf die Mischverzögerungszeit und das erforderliche Probeninjektionsvolumen aus. Vorgeschnittene Edelstahlrohre mit einem Innendurchmesser von 1 mm (0,04 Zoll) und einer Länge von 100 mm werden verwendet, um den dynamischen Mischer, die Mischerwahlventile (MSV1 und MSV2) sowie den ISV und OSV zu verbinden. Fluorierte Schläuche mit 1 mm Innendurchmesser und 115 mm Länge werden verwendet, um den ISV und OSV (oder den dynamischen Mischerausgang) mit der Probenzelle zu verbinden. Das gesamte Hohlraumvolumen, das die Mischverzögerungszeit beeinflusst, umfasst das Hohlraumvolumen des Mischers (0,15 ml), den Schlauch zwischen dem Mischerauslass und dem Probenzelleneinlass (0,09 ml) und das Probenzellenvolumen (0,16 ml). In diesem Beispiel beträgt das gesamte Hohlraumvolumen 0,4 ml. Die internen Hohlraumvolumina der Ventile sind im Vergleich zu den Hohlraumvolumina der Schläuche, des Mischers und der Probenzelle vernachlässigbar. So enthalten beispielsweise die eingesetzten Niederdruck-Wahlventile (0,75 mm Bohrungsdurchmesser) ein ungefähres Hohlraumvolumen von 4 μl, während die Hochdruck-Wahlventile und Umschaltventile (0,25 mm Bohrungsdurchmesser) ein ungefähres Hohlraumvolumen von 0,5 μl aufweisen.

Nach Abschluss der TR-SANS-Messung wird die Probe mit Lösungsmittel aus der Zelle gedrückt und wiederholt Spüllösungsmittel durch die Zelle gepumpt, um die Restprobe zu entfernen und die Probenzelle zu reinigen (Abbildung 2C). Beachten Sie, dass die Spülspritzen über Pumpenwahlwerte mit größeren Lösungsmittelbehältern (z. B. Wasser und Ethanol) verbunden sind, um sicherzustellen, dass zwischen den Messläufen ausreichende Lösungsmittelmengen zur Reinigung der Probenzelle zur Verfügung stehen. Lösungsmittelquellen, Probenquellen und gemischte Probenbehälter, die brennbare Flüssigkeiten enthalten, werden in einem separaten Gehäuse ohne elektrische Ausrüstung positioniert, um alle möglichen Zündquellen auszuschließen. Darüber hinaus werden dampfverschließende Flaschenverschlüsse verwendet, um brennbare Dämpfe und die Verdunstung von Lösungsmitteln zu minimieren. Schließlich wird die Probenzelle mit einem Stickstoffgasstrom getrocknet, um das restliche Spüllösungsmittel zu entfernen (Abbildung 2D). Der Stickstoffgasdruck am Eingang des Mischerwahlventils wird mit einem manuellen Druckregler an der Stickstoffgasflasche auf ca. 2 bar (0,2 MPa, Überdruck) geregelt. Sobald die Probenzelle ausreichend gereinigt und getrocknet ist, wird eine neu gemischte Probe für den nächsten Messzyklus in die Probenzelle injiziert (Wiederholung des Mischens und der Injektion, dargestellt im Flussdiagramm in Abbildung 2A).

Abbildung 2: Beispiel für ein Flussdiagramm mit einer Probenzelle, zwei Probenmischungen und zwei Spüllösungsmitteln zur Reinigung . (A) Mischen von Probe A (blau) und Probe B (rot) und anschließendes Einfließen der gemischten Probe (violett) in die Probenzelle. (B) Während der Datenerfassung befindet sich das Gerät mit gestopptem Durchfluss, in dem die ISV- und OSV-Umschaltventile geschlossen sind, um die Probenzelle zu isolieren und eine Rückdiffusion der Probe während der Datenerfassung zu verhindern. (C) Die Reinigungsschritte, bei denen die Probenzelle nach der Datenerfassung mit dem Spüllösungsmittel von SS1 (grün) gespült wird. (D) Trocknungsschritt, bei dem die Probenzelle mit Stickstoffgas (orange) getrocknet wird. Abkürzungen: PSV = Pumpenwahlventil; MSV = Mischer-Wahlventil; OSV = Auslassschalterventil; ISV = Einlassschalterventil; SS1 = Lösungsmittelquelle 1; SSA = Probenquelle A; N2 = Stickstoffgasquelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Abbildung 3 zeigt Flussdiagramme für eine etwas andere Version, bei der der Mischaufbau mit zwei separaten Probenzellen konfiguriert ist, die an dieselben Umschaltventile angeschlossen sind (Abbildung 3A). Während die TR-SANS-Daten in Probenzelle 1 erfasst werden, wird Probenzelle 2 gespült (Abbildung 3B) und getrocknet (Abbildung 3C). Wenn die Datenerfassung für Probenzelle 1 abgeschlossen ist, leitet das Einlassschaltventil eine neu gemischte Probe zur Datenerfassung in Probenzelle 2 (Abbildung 3D). Während die TR-SANS-Daten in Probenzelle 2 erfasst werden, wird Probenzelle 1 gespült und getrocknet (Abbildung 3E). Dieser alternierende, parallele Prozess zwischen zwei Probenzellen minimiert die Zeit zwischen nachfolgenden Probeninjektionen und maximiert die Nutzung der Neutronenstrahlzeit.

Abbildung 3: Beispiel für ein Flussdiagramm mit einer Zwei-Proben-Zellen, zwei Proben, die gemischt werden, und zwei Spüllösungsmitteln zur Reinigung. (A) Mischen von Probe A (blau) und Probe B (rot) und anschließendes Einfließen der gemischten Probe (violett) in Probenzelle 1. (B) Der Zustand des Geräts mit gestopptem Durchfluss während der Datenerfassung an Probenzelle 1, während Probenzelle 2 mit Lösungsmittel aus SS1 (grün) gespült wird. (C) Der Zustand des Geräts mit gestopptem Durchfluss während der Datenerfassung an der Probenzelle 1, während die Probenzelle 2 mit Stickstoffgas (orange) getrocknet wird. (D) Sobald die Datenerfassung der Probenzelle 1 abgeschlossen ist, wird sofort eine neue Probe (violett) gemischt und in die Probenzelle 2 eingebracht. (E) Der Zustand der Stoped-Flow-Vorrichtung während der Datenerfassung an Probenzelle 2, während Probenzelle 1 mit Lösungsmittel aus SS1 (grün) gespült wird. Während eine Probenzelle gemessen wird, wird die andere Probenzelle gereinigt und getrocknet. Der Stopped-Flow-Messprozess wechselt zwischen zwei Probenzellen, um die Zeit zwischen nachfolgenden Probenmischinjektionen zu minimieren. Abkürzungen: PSV = Pumpenwahlventil; MSV = Mischer-Wahlventil; OSV = Auslassschalterventil; ISV = Einlassschalterventil; SS1 = Lösungsmittelquelle 1; SSA = Probenquelle A; N2 = Stickstoffgasquelle. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Im Folgenden wird ein Schritt-für-Schritt-Protokoll für das Anschließen der Pumpen und Schlauchleitungen, das Ansaugen des Systems, das Spülen und Trocknen der Probenzelle und das Einspritzen der gemischten Probe beschrieben. Obwohl die Einzelzellenkonfiguration der Einfachheit halber demonstriert wird (Abbildung 2), können der flexible modulare Aufbau, das Protokoll und die Skripte leicht geändert werden, um mehr Spritzenpumpen, Ventile, Mischer oder Probenzellenkonfigurationen zu implementieren, wie z. B. die in Abbildung 3 gezeigte Konfiguration mit zwei Probenzellen. Repräsentative Rohdaten der Neutronenzählrate, die während der Misch- und Reinigungsinjektionszyklen gesammelt wurden, sind in Abbildung 4 dargestellt, während die bei 3 verschiedenen Temperaturen gemessene Lipidaustauschkinetik und die extrahierte normalisierte Streuintensität, die dem Anteil der ausgetauschten Lipide entspricht, in Abbildung 5 bzw. Abbildung 6 dargestellt sind.