Adaptation des organoïdes gastro-intestinaux à l’infection pathogène et au séquençage unicellulaire dans des conditions de biosécurité de niveau 3 (BSL-3)

Le tissu humain a été reçu de la résection du côlon ou des biopsies de l’iléon de l’hôpital universitaire de Heidelberg pour le protocole suivant. Cette étude a été réalisée selon les recommandations de l’hôpital universitaire de Heidelberg avec le consentement écrit éclairé de tous les sujets conformément à la Déclaration d’Helsinki. Tous les échantillons ont été reçus et conservés de manière anonyme. Le protocole a été approuvé par la commission d’éthique de l’hôpital universitaire de Heidelberg en vertu du protocole S-443/2017. 1. Entretien et passage des organoïdes intestinaux et du côlon ATTENTION : Les organoïdes intestinaux humains sont dérivés de tissus humains ou de cellules souches pluripotentes/embryonnaires induites, et à ce titre, une approbation éthique est requise. Les réglementations spécifiques à chaque pays doivent être suivies. Le matériel humain n’est généralement pas testé et est donc souvent considéré comme du matériel BSL-2. Des conditions de confinement appropriées doivent être confirmées dans le pays dans lequel l’expérience a lieu. Préparer les organoïdes intestinaux et colonaux à partir de tissus isolés et/ou de biopsies en utilisant les méthodes décrites précédemment2. En outre, des détails plus techniques sur la façon de préparer des organoïdes à partir de matériel dérivé du patient ou de CSPi peuvent être trouvés dans Lees et al. et Mahe et al.24,25. Une fois les cultures organoïdes établies, suivez la routine de fractionnement décrite ci-dessous pour préparer les organoïdes à effectuer des infections par des agents pathogènes entériques. Semer 20-100 organoïdes dans 50 μL de solution ECM à 100% dans des plaques traitées par culture non tissulaire à 24 puits. Ajouter 500 μL de milieu de croissance (Tableau 1) par puits. Changez le média tous les 2 jours en retirant 250 μL de l’ancien milieu et en ajoutant 250 μL du nouveau milieu de croissance à chaque puits. Réchauffez le support à la température ambiante avant de changer le support.ATTENTION : Les milieux froids liquéfient la solution ECM contenant des organoïdes. Passage des organoïdes une fois par semaine lorsque l’intérieur commence à devenir sombre en raison de l’accumulation de cellules mortes. Un exemple de ceci peut être trouvé dans la figure 2. Le jour du fractionnement, retirer la solution ECM de -20 °C et décongeler sur la glace. Placez la nouvelle plaque de culture cellulaire vide qui sera utilisée pour ensemencer les organoïdes après la scission à 37 °C (cela nécessite un minimum de 1 h pour être chaud et pourrait être réchauffé pendant la nuit). Réchauffer le milieu de culture à la température ambiante. Retirer le milieu de croissance avec une pipette P1000 et ajouter 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) froide 1x à chaque puits pendant 3 min pour liquéfier partiellement la solution ECM et se dissocier de la plaque. Pour éviter une perturbation complète de la solution ECM, utilisez une pipette P1000 (configurée à 450 μL). Pipette de haut en bas 10 fois pour remettre en suspension le PBS, la solution ECM et les organoïdes, transférer les organoïdes remis en suspension dans un tube conique de 15 mL et les placer sur la glace. Collectez plusieurs puits des mêmes organoïdes dans le même tube conique. Si plusieurs organoïdes différents (différents donneurs, différentes sections, différents prétraitements, etc.) sont divisés en même temps, collectez-les dans différents tubes coniques. Pendant la collecte, maintenez les tubes coniques sur la glace. Faire tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez soigneusement le PBS à l’aide d’une pipette pour maintenir la pastille organoïde au fond. Évitez d’utiliser un système de déchets sous vide avec une pipette ajustée car la pastille d’organoïdes est très lâche et peut facilement être aspirée lorsque vous retirez le PBS trop rapidement. Ajouter 1 mL de trypsine à 0,05 % au tube conique et remettre en suspension les organoïdes en pipetant de haut en bas 10 fois avec une pipette P1000. Incuber le tube conique contenant des organoïdes à 37 °C pendant 3 min. Ajouter 2 mL de milieuX DMEM/F12 contenant 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline/streptomycine pour arrêter la digestion et remettre en suspension pour perturber les organoïdes en pipetant de haut en bas 10 fois avec une pipette P1000. Faire tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez les tubes coniques de la centrifugeuse et stockez-les sur de la glace. Retirez soigneusement le média/trypsine à l’aide d’une pipette jetable de 5 mL pour maintenir la pastille organoïde au fond. Laissez environ 500 μL de média et retirez-le avec une pipette P1000. Une fois que le milieu/trypsine a été retiré de tous les tubes coniques, retirez la plaque traitée par culture non cellulaire de 24 puits de l’incubateur à 37 °C et placez-la sous le capot de culture cellulaire. Ajouter la solution ECM à 100% (conservée sur glace) au tube conique avec les organoïdes divisés au rapport 1:3 à 1:5 en fonction des habitudes de croissance des organoïdes du donneur individuel. (Par exemple, si un puits contenant de 20 à 100 organoïdes dans une goutte de 50 μL de solution ECM a été passé, remettre en suspension la pastille organoïde dans 150 à 250 μL de solution ECM glacée.) Semence 50 μL de solution ECM/mélange organoïde par puits de la plaque traitée par culture non cellulaire de 24 puits préchauffée à 37 °C.REMARQUE: La solution ECM se polymérise très rapidement une fois qu’elle s’est réchauffée. Gardez la solution ECM froide en tout temps (stockée sur de la glace) pendant l’utilisation. Lorsque les organoïdes ont été remis en suspension, semer immédiatement sur une nouvelle plaque. Pour les débutants, il est recommandé de stocker une boîte d’embouts de pipette à -20 °C pour laisser plus de temps pour l’ensemencement. Incuber la plaque de 24 puits à 37 °C pendant 10-15 min pour permettre à la solution ECM de polymériser. Après polymérisation, ajouter 500 μL de milieu de croissance (Tableau 1)26 à chaque puits et incuber les organoïdes à 37 °C. Vérifiez les organoïdes quotidiennement par microscopie. Changez le support tous les 2 jours comme à l’étape 1.4. 2. Préparation des organoïdes en deux dimensions (2D) pour l’infection apicale REMARQUE: Le protocole suivant décrira comment ensemencer des organoïdes intestinaux en tant que monocouche de cellules dans une plaque de culture cellulaire pour infecter les cellules de l’épithélium intestinal de leur côté apical. Utilisez la plaque de 48 puits pour les expériences de séquençage et la glissière de chambre à fond de verre de 8 puits pour contrôler l’infection à l’aide d’approches d’immunofluorescence. Cultiver et maintenir les organoïdes comme décrit à la section 1. Avant d’ensemencer les organoïdes en 2D, enduisez les plaques de 48 puits et la glissière de la chambre à fond de verre à 8 puits avec 200 μL de collagène humain à 2,5 % dans de l’eau par puits pendant 1 h à 37 °C.REMARQUE: Les organoïdes intestinaux sont mieux ensemencés dans des plaques de 48 puits et dans une glissière de chambre à fond de verre à 8 puits. L’expérience a montré qu’ils n’infectent pas bien dans les plaques de 96 puits. Les inserts Transwell peuvent également être utilisés pour permettre l’infection apicale et basolatérale en 2D. Si des transpuits sont utilisés, surveillez la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) avant l’infection pour confirmer une monocouche confluente. Normalement, les organoïdes intestinaux ont une barrière serrée avec un TEER de 450-600 Ohm/cm2. Ensemencez 100 à 150 organoïdes dans chaque puits d’une plaque de 48 puits ou pour un puits d’une glissière de chambre à fond de verre de 8 puits. Pour estimer le nombre d’organoïdes, compter le nombre d’organoïdes présents dans la goutte de solution ECM de 50 μL de la plaque de 24 puits préparée à la section 1. En moyenne, 1 à 2 puits sont nécessaires, ce qui donnera environ 15 000 à 30 000 cellules. Pour perturber la solution ECM et essayer les organoïdes, suivez les étapes 1.8-1.17. Retirez le collagène humain des plaques à 48 puits et de la glissière de la chambre à fond de verre à 8 puits. Remettre en suspension la pastille organoïde dans le tube conique dans 250 μL de milieu de croissance/puits et ajouter le mélange aux puits recouverts de collagène. Placez la plaque dans un incubateur à 37 °C.REMARQUE: Lors de la réalisation des expériences, plusieurs conditions sont comparées (simulation vs traitement infecté +/- d’intérêt). Pour minimiser la variabilité entre chaque puits d’organoïdes ensemencés en 2D, collectez le nombre total d’organoïdes nécessaires dans le même tube conique. La collecte d’organoïdes dans jusqu’à 12 puits d’une plaque de 24 puits peut utiliser 1 mL de trypsine et 2 mL de milieu neutralisant. Lorsque vous utilisez 12 à 24 puits, augmentez ce nombre à 2 mL de trypsine et à 4 mL de milieu neutralisant. Après 48 h, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la dans la hotte de culture cellulaire. Retirez le milieu de croissance et remplacez-le par 250 μL par puits de milieu de différenciation (tableau 1). Répétez ce changement de média 48 h plus tard. Après 48 h, confirmer la différenciation (quatre jours après le passage au milieu de différenciation) en extrayant de l’ARN, en fabriquant de l’ADNc avec 250 ng d’ARN et en effectuant une qPCR à base de vert SYBR à l’aide d’amorces pour les cellules souches (OLFM4 et / ou SMOC2), les cellules gobelet (MUC2), les cellules entéroendocrines (CHGA) et les entérocytes (SI et / ou CYP3A4) (Figure 3).REMARQUE: En passant des milieux de croissance aux milieux de différenciation, les organoïdes diminueront leur expression de marqueurs de cellules souches (OLFM4 et / ou SMOC2) et augmenteront l’expression des cellules de gobelet (MUC2), des cellules entéroendocrines (CHGA) et des marqueurs d’entérocytes (SI et / ou CYP3A4) par qPCR. Préparez un puits supplémentaire et maintenez avec le milieu de croissance pour comparer le niveau d’expression de chaque marqueur spécifique au type de cellule dans le milieu de croissance par rapport au milieu de différenciation. Après confirmation de la différenciation, les organoïdes sont prêts pour l’infection apicale. Déplacez les organoïdes vers le niveau de confinement de biosécurité requis pour l’agent pathogène de votre choix.ATTENTION : Veuillez consulter les règlements locaux et les procédures d’exploitation normalisées de l’institut lorsque vous manipulez des agents pathogènes sous confinement BSL-2 ou BSL-3. Pour infecter les organoïdes intestinaux cultivés en 2D de leur côté apical, prélever le milieu avec une pipette P1000 et ajouter l’agent pathogène dilué à la multiplicité d’infection requise pour l’expérience dans les milieux de différenciation (le volume minimum de mélange pathogène/milieu est de 50 μL par puits et le volume maximal est de 250 μL par puits). Laissez l’infection se poursuivre pendant 2 h à 37 °C avec une table à bascule située dans l’incubateur de culture cellulaire ou en berçant manuellement la plaque toutes les 15-20 minutes. Optimisez ce temps en fonction de l’agent pathogène de votre choix. Après 2 h, retirer le média avec une pipette P1000 et le remplacer par 250 μL par puits de fluide de différenciation frais. Incuber les cellules à 37 °C jusqu’au point temporel du séquençage unicellulaire. Pour préparer les cellules au séquençage unicellulaire, passez à la section 4. 3. Préparation des organoïdes en trois dimensions (3D) pour l’infection apicale et basolatérale Cultiver des organoïdes comme décrit à la rubrique 1 dans une plaque traitée par culture non cellulaire de 24 puits. Deux jours après le passage, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la dans une hotte de culture cellulaire. Retirez le milieu de croissance à l’aide d’une pipette P1000, remplacez-le par 500 μL/puits de milieu de différenciation préchauffé à température ambiante et placez la plaque dans l’incubateur à 37 °C. Après 48 h, remplacer par un nouveau milieu de différenciation (500 μL/puits).REMARQUE: Les organoïdes sont maintenus dans des milieux de différenciation pendant un total de 4 jours avant l’infection. Confirmer la différenciation comme décrit à l’étape 2.9. Après confirmation que la différenciation s’est produite, les organoïdes sont prêts pour l’infection. Décongeler l’ECM sur la glace. Réchauffer le milieu de différenciation à la température ambiante et réchauffer une plaque de 24 puits à 37 °C. Pour effectuer des infections, retirez les organoïdes de la solution ECM.REMARQUE: Retirez autant de solution ECM que possible car les virus préfèrent coller à la solution ECM plutôt qu’aux cellules. S’il reste trop de solution ECM autour des organoïdes, l’infectiosité sera gravement affectée. Perturbez l’ECM en ajoutant 500 μL de PBS froid 1x et en incubant pendant 3 min. Utilisez un P1000 pour pipeter de haut en bas 10x. Mélanger les organoïdes dans un tube et centrifuger à 500 x g pendant 5 min. Retirez PBS avec un P1000.REMARQUE: Pour minimiser la variabilité entre chaque condition d’infection, combinez les organoïdes provenant de plusieurs puits d’une plaque de 24 puits dans le même tube conique. Par exemple, si huit conditions d’infection sont requises, huit puits d’une plaque de 24 puits (contenant environ 100 organoïdes chacun) seront combinés et ensuite divisés en huit puits d’une nouvelle plaque de 24 puits à la suite d’une perturbation de l’aiguille (voir l’étape 3.12). Remettre en suspension les organoïdes dans 1 mL de milieu de différenciation. Pour l’infection apicale et basolatérale, suivez l’étape 3.10.1 et pour l’infection basolatérale, suivez uniquement l’étape 3.10.2. Fixez une aiguille de 27 G à une seringue de 1 mL et remettez la pastille six fois pour permettre la perturbation des organoïdes et pour que l’infection se produise à la fois sur les côtés apical et basolatéral. Passez à l’étape 3.11.REMARQUE: Les organoïdes doivent être les organoïdes classiques ressemblant à des kystes et à bourgeons de poulpe avec un centre sombre lorsqu’ils sont observés avant la perturbation de l’aiguille. Après la perturbation, ces organoïdes apparaîtront plus petits avec moins ou pas d’intérieur sombre. Lors de l’infection, il y aura toujours un minimum de deux conditions (simulacre et infection), un minimum de deux puits d’une plaque de 24 puits sera initialement combiné dans un tube conique de 15 mL pour la perturbation à l’aiguille (expliquant pourquoi un minimum de 1 mL est utilisé pour la remise en suspension). Lorsque vous effectuez plus de deux conditions, combinez jusqu’à 10 puits d’une plaque de 24 puits dans un seul tube conique de 15 mL et remettez en suspension dans 1 mL de milieu de différenciation pour la perturbation de l’aiguille. Après la perturbation, ajoutez 500 μL de milieux de différenciation par n + 1 (par exemple, si vous utilisez 10 puits, puis complétez avec 4,5 mL pour avoir un total de 5,5 mL). Si plus de 10 conditions sont nécessaires, utilisez plusieurs tubes coniques. Une seringue de 1 mL est recommandée car les organoïdes sont mieux perturbés avec ce volume de la seringue. Une alternative à une seringue consiste à utiliser une pointe P1000 bien aplatie. Remettre en suspension les organoïdes dans 500 μL de milieux de différenciation par puits. Veillez à ne pas perturber les organoïdes et assurez-vous que le côté apical n’est pas accessible. Passez à l’étape 3.11. Transférer 500 μL de suspensions organoïdes par puits sur une plaque de culture cellulaire de 24 puits à l’aide d’une pipette P1000 et déplacer la plaque vers le niveau de confinement de biosécurité requis pour l’agent pathogène de son choix.ATTENTION : Se référer aux réglementations locales et aux procédures opérationnelles normalisées de l’institut lors de la manipulation d’agents pathogènes sous confinement BSL-2 ou BSL-3. Effectuez toujours la perturbation de l’aiguille des organoïdes à l’extérieur du BSL-3 pour éviter les accidents potentiels avec l’aiguille. Les réglementations locales peuvent également empêcher l’utilisation d’aiguilles dans le BSL-3. Ajouter l’agent pathogène dilué dans un milieu de différenciation pour atteindre la multiplicité d’infection requise pour l’expérience. Ne pas dépasser un volume total de 500 μL (pour avoir 1 mL au total dans la plaque de 24 puits). Laisser l’infection se poursuivre pendant 2 h (ce temps devra être adapté à l’agent pathogène de votre choix) à 37 °C avec une table à bascule située dans l’incubateur de culture cellulaire ou en berçant manuellement la plaque toutes les 15-20 minutes. Après 2 h d’incubation, recueillir les organoïdes dans un tube de 1,5 mL par condition et tourner à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le milieu contenant l’agent pathogène à l’aide d’une pipette P1000 et conservez-le sur de la glace. Lavez les pastilles organoïdes une fois avec PBS. Remettre en suspension les organoïdes dans 50 μL de solution ECM à 100 % (qui a été précédemment décongelée sur de la glace), plaquer dans une plaque traitée par culture non cellulaire à 24 puits préchauffée à 37 °C et incuber la plaque de 24 puits à 37 °C pendant 10-15 min pour permettre à la solution ECM de polymériser. Après polymérisation, ajouter 500 μL de milieux de différenciation à température ambiante à chaque puits et incuber à 37 °C jusqu’à la récolte pour le séquençage unicellulaire.REMARQUE: Si la récolte doit avoir lieu plus de 48 heures après l’ensemencement, changez le milieu tous les 2 jours en retirant l’ancien milieu et en le remplaçant par 500 μL de milieu de différenciation frais. Cependant, l’expérience a montré que puisque les organoïdes sont cultivés sous des milieux de différenciation, ils ne survivront pas beaucoup plus longtemps que 48 h. 4. Préparation d’une solution unicellulaire et préparation de billes de gel en émulsion (GEM) dans des conditions de biosécurité de niveau 3 (BSL-3) REMARQUE: L’achèvement des étapes suivantes nécessite que l’équipement de séquençage à cellule unique(Table des matériaux)et une machine pcr capable de gérer des réactions de 100 μL soient présents à l’intérieur d’une installation BSL-3. Les organoïdes sont cultivés comme décrit dans la rubrique 1 et infectés comme décrit dans les rubriques 2-3 en fonction de l’agent pathogène et de la voie d’entrée. À un moment prédéterminé après l’infection, les organoïdes sont prélevés. Ci-dessous, la méthode utilisée pour prélever des organoïdes intestinaux est décrite. Avant de prélever les organoïdes infectés, retirer les billes de gel unicellulaire (Table des matériaux) de -80 ° C et les réchauffer à température ambiante (au moins 30 minutes avant). De plus, équilibrez le réactif RT, l’agent réducteur B et l’enzyme RT C (tous stockés à -20 °C) à la température ambiante. Remettez en suspension l’oligo du commutateur de gabarit comme décrit dans les instructions du fabricant.REMARQUE : Toutes les étapes suivantes doivent être effectuées en ce qui concerne les règlements locaux sur la prévention des risques biotechnologiques conformément à la procédure d’exploitation normalisée établie pour l’agent pathogène considéré. En règle générale, pour le travail BSL-3, il faut s’assurer que l’extérieur de tous les récipients (plaques, tubes, etc.) sortant d’une hotte de culture cellulaire est correctement désinfecté. Il en va de même pour les mains/gants de la personne qui effectue les expériences. Pour effectuer des infections sur des organoïdes ensemencés en 2D (section 2), passez à l’étape 4.4. Pour effectuer des infections sur organoïdes 3D (section 3), passez à la rubrique 4.5. Pour les infections d’organoïdes 2D, apportez la plaque de culture cellulaire dans le capot et retirez le support de différenciation avec une pipette P1000. Ajouter 250 μL de 1x PBS à température ambiante à chaque puits. Retirez le PBS avec une pipette P1000 et ajoutez 250 μL d’enzyme de dissociation à température ambiante (p. ex. TrypLE Express) à chaque puits d’une plaque de 48 puits. Changez de gants, nettoyez la plaque et placez la plaque avec l’enzyme de dissociation dans l’incubateur à 37 °C. Observez la dissociation cellulaire par microscopie toutes les 5 minutes.REMARQUE: Environ 15 minutes pour dissocier les organoïdes intestinaux cultivés en 2D en cellules individuelles. Ce temps devra être ajusté car il dépendra du nombre d’organoïdes initialement ensemencés et infectés ainsi que de l’agent pathogène car certains agents pathogènes sont plus cytopathiques et provoquent la dissociation des organoïdes beaucoup plus rapidement que d’autres. Après confirmation d’une suspension monocellulaire apparente, ramener la plaque dans la hotte de culture cellulaire et arrêter la digestion en ajoutant 250 μL de milieu DMEM/F12 contenant 10 % de FBS par puits d’une plaque de 48 puits. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 mL à l’aide d’une pipette P1000. Changez de gants, nettoyez le tube et faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez soigneusement l’enzyme de milieu/dissociation avec un P1000 pour maintenir la pastille cellulaire au fond. Remettre en suspension des cellules individuelles dans un volume minimal de PBS contenant 0,1 % de BSA. Pour les organoïdes intestinaux, remettre en suspension 250 μL pour chaque puits de la plaque de 48 puits. Passez les suspensions cellulaires dans un tube FACS avec un filtre pour enlever les gros amas et placez le tube FACS contenant des cellules sur de la glace. Passez à l’étape 4.6 pour continuer avec le comptage des cellules et la préparation du mélange maître. Pour les infections d’organoïdes 3D, retirez la plaque de l’incubateur et placez-la dans la hotte de culture cellulaire. Retirez le support de différenciation de chaque puits de la plaque de 24 puits à l’aide d’une pipette P1000. Ajouter 500 μL de PBS glacé 1x à chaque puits et incuber pendant 3 min sur de la glace. Pour éviter une perturbation complète de la solution ECM, utilisez une pipette P1000 (réglée sur 450 μL). Pipette de haut en bas 10 fois pour remettre en suspension le PBS, la solution ECM et les organoïdes; transférer les organoïdes remis en suspension dans un tube conique de 15 mL et les placer sur de la glace. Recueillir chaque condition d’infection dans son propre tube conique de 15 mL.REMARQUE: L’utilisation d’un tube conique de 15 mL donne une pastille cellulaire meilleure et plus distincte qu’un tube conique de 50 mL ou un tube de 1,5 mL. Changez de gants et retirez le tube de la cagoule de culture cellulaire. Nettoyez l’extérieur du tube. Faire tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Replacez le tube dans la hotte de culture cellulaire et retirez le PBS avec une pipette P1000 pour éviter de remettre en suspension les pastilles organoïdes du fond du tube. Remettre la pastille dans 1 mL d’enzyme de dissociation (p. ex. TrypLE Express). Changez de gants, nettoyez le tube et incubez les échantillons à 37 °C. Toutes les 10 minutes pendant 30 minutes, replacez le tube dans la hotte de culture cellulaire et remettez en suspension les organoïdes en pipetant de haut en bas avec une pipette P1000 10 fois.REMARQUE: Normalement, les organoïdes intestinaux ont besoin d’environ 30 minutes pour former une suspension cellulaire unique lorsqu’ils sont infectés en 3D. Pour déterminer quand les organoïdes sont dissociés en cellules individuelles, prélever 10 μL de la suspension organoïde à l’aide d’une pipette p10. Placez la suspension dans une glissière de comptoir de cellule en plastique jetable. Scellez le port d’entrée de l’échantillon avec du ruban adhésif transparent. Changez de gants et nettoyez l’extérieur du comptoir cellulaire. Utilisez un microscope à fond clair pour déterminer si une suspension à cellule unique est faite. Après confirmation d’une suspension à cellule unique, arrêtez la digestion en ajoutant 1 mL de milieu DMEM/F12 contenant 10 % de FBS et pipette de haut en bas 10 fois avec une pipette P1000. Changez de gants, nettoyez le tube et faites tourner les échantillons à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirez soigneusement l’enzyme de milieu/dissociation à l’aide d’une pipette P1000 pour éviter de remettre en suspension la pastille de cellule du fond du tube. Remettre en suspension les cellules individuelles dans un volume minimal de PBS contenant 0,1% de BSA. Pour les organoïdes intestinaux, remettre en suspension dans 250 μL. Passez les suspensions cellulaires dans un tube FACS avec un filtre pour enlever les gros amas et placez le tube FACS contenant des cellules sur de la glace. Passez à l’étape 4.6 pour continuer avec le comptage des cellules et la préparation du mélange maître. Déterminez le nombre de cellules par μL en ajoutant 10 μL de la suspension cellulaire à une chambre de comptage de cellules en plastique jetable. Scellez le port d’entrée de l’échantillon avec du ruban adhésif transparent avant de retirer l’échantillon de la hotte de culture cellulaire, car à ce stade, la suspension cellulaire est toujours infectieuse. Changez de gants, nettoyez la chambre de comptage des cellules et comptez le nombre de cellules à l’aide d’un microscope à fond clair. À l’intérieur de la hotte de culture cellulaire, préparez un mélange maître de réactif RT, d’oligo de commutateur de gabarit, d’agent réducteur B et d’enzyme RT C dans un tube de 1,5 mL conformément aux instructions du fabricant en fonction du nombre d’échantillons dans l’expérience. Pour chaque échantillon, aliquote 33,4 μL de mélange maître dans un tube PCR et conserver sur de la glace. Ajouter les cellules et l’eau au mélange maître en fonction du numéro de cellule cible décrit dans les instructions du fabricant.REMARQUE: 50% à 60% des cellules sont normalement récupérées (c’est-à-dire que lors du chargement de 10 000 cellules sur la puce, 5 000 à 6 000 cellules sont utilisées pour l’analyse). Par conséquent, chargez toujours 10 000 cellules. Si la densité de la cellule ne le permet pas, centrifugez les cellules et remettez-les en suspension dans un volume inférieur. Veillez à ne pas surcharger la puce car cela entraînerait un colmatage de la puce. De plus, si les cellules ne sont pas correctement dissociées, il y aura un risque accru d’obtenir plusieurs cellules par perle, qui devront être éliminées dans le traitement bioinformatique en aval. Changez les gants, déplacez le contrôleur à cellule unique dans la hotte de culture cellulaire et préparez la puce car la puce n’est recouverte que d’un joint qui n’est pas scellé.REMARQUE: La machine doit être à l’intérieur de la hotte pour éviter l’exposition aux suspensions cellulaires infectées et aux aérosols potentiels. Ajoutez la puce à cellule unique au porte-puce et remplissez les voies inutilisées avec 50% de glycérol. Ajoutez le mélange principal, les perles et l’huile de cloisonnement aux voies utilisées pour les échantillons conformément aux instructions du fabricant. Couvrez la puce avec le joint, chargez la puce dans le contrôleur et démarrez le programme.REMARQUE: Il est recommandé de ne charger que six des huit voies. Des problèmes d’émulsions inappropriées se produisent souvent dans les voies un et huit. L’entreprise affirme que toutes les voies sont indépendantes et que cela ne devrait pas se produire; cependant, si possible, évitez ces deux voies et faites fonctionner deux puces si huit échantillons sont nécessaires. À la fin du programme, retirez la puce et le joint. Utilisez une pipette multicanal et transférez 100 μL des émulsions dans un tube PCR propre. Assurez-vous que chaque puits a une couleur blanche uniforme indiquant qu’une émulsion complète s’est produite. Changez de gants, nettoyez les tubes et transférez le tube PCR sur une machine PCR pouvant prendre en charge des réactions de 100 μL. Exécutez le programme : 53 °C pendant 45 min ; 85 °C pendant 5 min. Une fois terminé, conservez les échantillons à 4 °C. À ce stade, traiter la réaction selon les instructions du fabricant ou conserver à 4 °C pendant 3 jours ou à -20 °C pendant 1 semaine. Après 5 min à 85 °C, la plupart des virus enveloppés seront inactivés, retireront l’ADNc du BSL-3 selon la procédure normale de fonctionnement et effectueront les préparations de la bibliothèque dans un laboratoire BSL-1.REMARQUE: Cette expérience doit être réalisée sous la forme de trois répliques biologiques (par exemple, sur trois jours différents) parce que l’étendue de la différenciation de chaque type de cellule peut varier légèrement entre chaque expérience. Les bibliothèques de séquençage résultantes peuvent être indexées et séquencées différemment en une seule exécution de séquençage.