使用单细胞荧光成像对菌际竞争进行量化

1. 细菌菌株的优化 选择两种细菌菌株进行单细胞细菌竞争检测。在这里，使用了两种V.fischeri菌株：目标菌株（ES11424）和抑制剂菌株（MJ1125），已知使用染色体II（T6SS2）1上的VI型分泌系统杀死目标菌株，这是一种依赖接触的杀伤机制。 确定实验的适当控件。在此示例中，适当的控制是与目标菌株同时孵育野生型和 T6SS 突变抑制剂菌株，以量化 T6SS 介质杀灭的效果。注：其他控制可以包括一个目标菌株，表达必要的免疫基因，以防止T6SS依赖性杀死或抑制剂突变菌株表达野生类型的变异基因副本在跨恢复T6SS活动1。 在可能的情况下，将具有稳定质粒编码基因的菌株转换为不同荧光蛋白（例如 GFP 或 RFP），以便在显微镜上直观地区分菌株类型。在这里，抑制剂菌株被标记为GFP编码质粒（pVSV102），目标菌株标记为dsRed编码质粒（pVSV208）26。注意：如果不能使用稳定的质粒，荧光标签可以引入细菌染色体上，用于可视化27，28。 在初始优化期间，在实验期间将用于的每个荧光滤镜下标记菌株的图像克隆培养，以确保细胞仅在预期通道中可见。例如，确保 GFP 标记菌株仅在 FITC 通道中可见。 2. 阿加罗斯垫准备 通过将 2% 低熔化的阿加罗斯 （w/v） 溶解到 mPBS 中，准备阿加罗斯垫解决方案。在微波炉和漩涡中短暂加热溶液，直到玫瑰完全溶解。将溶液放在 55°C 的水浴中保暖，直到准备好使用。有关准备阿加罗斯垫的更多信息，请参阅 讨论 部分。注：在这里，mPBS 是通过在标准 1x PBS 中添加 20 克/升 NaCl 来准备的。 将一块实验室胶带包裹在玻璃滑梯上五次。在同一幻灯片上第二次重复此过程，使两块胶带之间的距离略小于覆盖唇的宽度（图1A）。例如，如果使用 25 mm2 盖片，则磁带片应间隔约 20 mm。注：虽然可以修改胶带缠绕在滑梯上的次数以调整玫瑰垫的厚度，但重要的是胶带层在滑梯两侧的高度相同，以便胶带垫保持平整。 派佩特在两片胶带之间加热玫瑰溶液，并立即用盖片顶部，使其落在胶带片上。这将确保玫瑰垫的表面保持平坦。此步骤中管道的气溶液体积应足以使盖唇与液体接触，并推出气糖溶液中的任何气泡。对于这个特殊的设置，200微升的暖气是足够的。 在硬币孵化分析之前，让玫瑰垫在室温下凝固至少 1 小时。第2.2步将产生一个约20毫米2的玫瑰垫。 将此玫瑰垫用剃须刀刀片切割成四个 5 mm2 垫，用于成像。注：Agarose 垫可在实验前一周制成，并储存在 4°C 的空无菌 Petri 板中，用准胶片密封，以防止干燥。 3. 为共同孵化准备菌株 将每个菌株从 -80 °C 库存中分离出来，在 24°C 下隔夜孵育到 LBS Agar 板上，并辅以适当的抗生素。 例如，使用三种菌株：野生型抑制剂菌株、VI型分泌系统突变菌株和目标菌株。 第二天，从每个菌株中挑选两个菌落，在LBS介质中重新使用适当的抗生素，并在24°C时在24°C下孵育过夜，在200转/分时摇晃，从而开始生物复制的通宵培养。 第二天早上，每个生物的亚文化复制1：1000到新鲜的LBS介质没有抗生素和孵育在24°C与颤抖4-5小时或直到细胞达到OD600 的+1.5。注：步骤 3.1、3.2 和 3.3 的时机可能需要针对不同的细菌物种进行优化，因为它们的生长速度可能差异很大。对于此测定，细胞在硬币孵化分析开始时处于中记录阶段。 4. 硬币菌株 从第 3.3 步的中日志培养物开始，测量并记录所有样品的光学密度为 600 nm （OD600）。 通过稀释 LBS 介质的培养物，将每个样品标准化为 OD600 = 1.0，对应于V. fischeri的大约10 9 CFU/mL。 将两个相互竞争的菌株以 1：1 的比例混合在一起，根据体积将每个规范化菌株的 30 μL 添加到标记为 1.5 mL 的管中。漩涡的混合应变培养为 1- 2 s 。注意：在某些情况下，将共同文化混合到不同比例可能是合适的。例如，当一个菌株的生长速度比另一个菌株快得多时，可能需要以数字优势启动生长较慢的菌株，以便观察竞争。如果 OD600 与两种菌株的类似 CFU/mL 不对应，则可能需要优化。 对于每个生物复制和治疗，重复步骤 4.3。在此示例中，这将总共产生四个混合应变管：两个生物复制与野生型抑制剂菌株与目标菌株混合，两个生物复制与六型分泌系统突变菌株与目标菌株混合。 为了确保相互竞争的细胞足够密集，在阿加垫上的硬币孵化中产生接触依赖性杀灭，通过在标准的 1.5 mL 离心机管中离心将混合培养物离心 1 分钟，以 21，130 x g的速度将每个混合培养物集中到 3 倍，丢弃超高分子，并在 20 μL LBS 介质中重新吸收每个颗粒。每个示例重复。注：一些细菌细胞对高rcf离心损伤敏感：在这种情况下，混合培养可以离心3分钟在4600×g 29。此外，在量化依赖接触的竞争时，确保幻灯片上的细胞密度足以观察杀戮非常重要。在本文中，”拥挤”的治疗，其中观察到杀戮，有大约10个细胞/20μm2：有关更多信息，请参阅讨论部分。 5. 幻灯片设置 使用直立显微镜时，将 +5 mm2 玫瑰垫放在标准 1 mm 玻璃滑梯上。将混合培养的 2 μL 点放在 agarose 垫上，并放置一个 #1.5 盖片（25 mm2）。请参阅 图 1B 以示示。 使用倒置显微镜时，将混合培养的 2 μL 点到 35 mm Petri 盘的 #1.5 盖片底部，并在硬币孵化点上放置 +5 mm2 玫瑰垫。在玫瑰垫上放置一个 12 mm 的圆形玻璃盖片。请参阅 图 1C 以示示。 重复步骤 5.1 或 5.2，具体取决于使用的显微镜设置，用于其余三种混合培养物，从而对四个幻灯片或菜肴进行成像。 允许幻灯片在台面上坐约 5 分钟，然后继续第 6 步。这允许细胞在阿加垫上安顿下来，并在成像过程中消除运动。 6. 荧光显微镜 首先，使用白光（相位对比度或DIC）聚焦细胞，以尽量减少光漂白的影响。根据单个细菌细胞的平均大小，使用 60 倍或 100 倍的油目标。 调整每个通道的曝光时间和采集设置，以便在适当的通道中以最小的背景检测来可见细胞。注：对于不同的通道使用不同的暴露时间是合适的，但相同的暴露时间应用于所有生物复制和给定通道的治疗。 对于每个示例，选择至少五个视图字段 （FOV），并使用第 6.2 步的采集设置在每个适当的通道中获取图像（见 图 2中的示例）。从每个 FOV 中保存 XY 点，以便在最后的时间点中对相同的 FOV 进行成像。在分析步骤中确定目标或抑制剂细胞所占用的区域比例，需要在每个时间点成像相同的 FOV。注：在此示例中，使用激发波长为 467 – 498 nm 的过滤器和 513 – 556 nm 的排放过滤器检测 GFP 的荧光，并且为假彩色绿色。dsRed 的荧光使用激发波长为 542 – 582 nm 的过滤器和 603 – 678 nm 的排放过滤器检测，并且为假色品红色。 2 小时后，使用以前保存的 XY 点（图 2）重复每个示例的步骤6.3。注：对于具有不同增长率或竞争机制的生物体，可能需要优化后续图像的拍摄时间。 7. 斐济的图像分析 使用此处找到的说明下载并安装 FIJI 图像处理软件：https://imagej.net/Fiji/Downloads 打开 FIJI 并导入图像文件进行分析。注意：在大多数情况下。TIFF 文件将用于图像分析，尽管某些图像采集软件将使用专有文件类型进行导出。FIJI 可以识别大多数专有文件类型，图像可以导入并分析如下。 对于在步骤 6.3 和 6.4 中获取的每个图像，将图像转换为灰度，分离通道，并首先通过阈值（Ctrl + Shift + T）创建预处理图像的二进制掩码（图 3A，B）。注意：这里使用 FIJI 中的默认阈值设置。在某些情况下，可能需要更改这些设置，在这种情况下，该实验中的所有图像都应使用相同的设置。 设置图像上的刻度（分析|设置刻度） 使用显微镜设置23的适当值。 设置测量（分析|设置测量）和选择 区域。注：如果其他测量结果适合实验，则可以添加其他测量结果。此处显示的示例分析仅需要对象 区域 测量。 分析粒子（分析|使用默认设置（图3C）分析粒子。如果样品中有碎屑，可能需要调整大小或圆形以过滤掉非细胞颗粒。选择显示|大纲，使这种分析的输出将包括所有粒子分析的编号轮廓（图3D）。注：将 图 3D 中的轮廓与初始图像进行比较在优化步骤中尤为重要，以确保 （1） 所有单元格都经过分析，（2） 任何碎屑都排除在分析之外。 将第 7.4 步（图 3E）的测量结果导出到电子表格软件中，以便进一步分析和绘制。 对于在实验过程中获得的所有通道和图像，重复步骤 7.1 – 7.5。 8. 计算初始目标面积的百分比 对于第 7 节中分析的每个视场，确保导出的文件包含分析的每个粒子的单独区域测量。从目标应变的荧光通道开始，计算每个视场的总粒子面积。对于两个生物复制，每个 FOV 有五个 FOV，这应导致每次治疗的 10 个总和区域。 使用以下方程计算每个 FOV 初始目标面积的百分比： （ ） 重复此计算的所有治疗和图形的初始目标面积的百分比（从步骤8.2方程的结果）为每个治疗（图4A）。 确定目标人口（指示增长）、目标人口净减少（指示死亡）或每次治疗是否有变化（指示没有增长或死亡）。注：值大于 100 的初始目标区域的百分比表示目标净增长，低于 100 的值表示净目标死亡。初始目标值的百分比保持在 100 表示目标人口没有净变化。请参阅讨论建议的后续实验。 9. 计算初始抑制剂面积的百分比 重复步骤 8.1 到 8.3，这次使用从抑制剂菌株荧光通道收集的测量结果（图 4B）。 确定抑制剂人口（增长）是否净增长;抑制剂数量（死亡）的净减少，或每次治疗无变化。大于 100 表示净抑制剂生长，值低于 100 表示净抑制剂死亡。