القياس الكمي للمنافسة بين البكتيريا باستخدام التصوير الفلوري أحادي الخلية
Summary
تصف هذه المخطوطة طريقة لاستخدام المجهر الفلوري أحادي الخلية لتصور المنافسة البكتيرية في الزراعة المشتركة وتحديدها كميا.
Abstract
المنافسة بين البكتيريا يمكن أن تؤثر بشكل مباشر على بنية ووظيفة الميكروبيوم. يصف هذا العمل نهج المجهر الفلوري الذي يمكن استخدامه لتصور وقياس التفاعلات التنافسية بين السلالات البكتيرية المختلفة على مستوى الخلية الواحدة. يوفر البروتوكول الموصوف هنا أساليب للنهج المتقدمة في إعداد الشرائح على المجاهر المستقيمة والمقلوبة ، وتقنيات التصوير بالخلايا الحية والفاصل الزمني ، وتحليل الصور الكمية باستخدام برنامج فيجي مفتوح المصدر. يوضح النهج في هذه المخطوطة التحديد الكمي للتفاعلات التنافسية بين مجموعات Vibrio fischeri التكافلية من خلال قياس التغير في المساحة بمرور الوقت لسلالتين متفاعلتين تعبران عن بروتينات فلورية مختلفة من البلازميدات المستقرة. يتم وصف طرق بديلة لتحسين هذا البروتوكول في أنظمة النموذج البكتيري التي تتطلب ظروف نمو مختلفة. على الرغم من أن المقايسة الموصوفة هنا تستخدم الظروف الأمثل لV. fischeri، فإن هذا النهج قابل للاستنساخ للغاية ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة المنافسة بين العزلات القابلة للتكرار من الميكروبيوم المتنوعة.
Introduction
توضح هذه المقالة طريقة لقياس المنافسة البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام المجهر الفلوري. غالبا ما يتشكل هيكل ووظيفة المجتمعات الميكروبية من خلال التفاعلات التنافسية بين الميكروبات ، وفي كثير من الحالات يتطلب توصيف هذه التفاعلات مراقبة السلالات البكتيرية المختلفة في التنبيب1و2و3و4و5و6و7و8 . تقليديا، يتم قياس المنافسة البكتيرية على مستوى السكان عن طريق عد وحدات تشكيل مستعمرة (CFUs) من المثبطات والسلالات المستهدفة قبل وبعد فترة التنبيب2،9. وتوزع آليات المنافسة الميكروبية على نطاق واسع بين البكتيريا وقد تعتمد على الانتشار أو الاتصال الخلوي لمنع الخلاياالمستهدفة10و11و12و13و14و15و16و17و18و19.
على الرغم من أن السلالات البكتيرية غالبا ما تلاحظ في عملية التكبيب على مستوى السكان، إلا أن هذه المخطوطة تحدد المقايسة للقياس الكمي للخلية الواحدة للمنافسة البكتيرية. وعلاوة على ذلك، يتضمن هذا العمل اقتراحات لتكييف البروتوكول للاستخدام مع الأنواع البكتيرية الأخرى. في حين يتم استخدام تقنيات محددة في هذه المقالة لدراسة المنافسة داخل المحددة التي تعتمد على الاتصال بين سلالات من البكتيريا التكافلية Vibrio fischeri20،21،22، يمكن تكييفها للمنافسة بين العديد من الكائنات الحية. توفر هذه المقالة إرشادات لإعداد الشرائح على المجاهر المستقيمة والمقلوبة على حد سواء، ويتم وصف جميع التحليلات باستخدام برنامج فيجي23 مفتوح المصدر بحيث يمكن استخدام الطريقة من قبل الباحثين الذين يمكنهم الوصول إلى أجهزة التصوير وبرامج التحليل المختلفة. ونظرا لأهمية دراسة المنافسة الميكروبية على مستوى السكان والخلايا الواحدة على حد سواء، فإن هذه الطريقة ستكون موردا قيما للباحثين لتحديد التفاعلات التنافسية، ولا سيما تلك التي لا تملك إمكانية الوصول إلى برامج التحليل الخاصة.
Protocol
Representative Results
Discussion
يوفر البروتوكول المذكور أعلاه أداة قوية لتحديد المنافسة بين البكتيريا ووصفها على مستوى الخلية الواحدة. هذا المقايسة، التي تم تطويرها عن طريق تعديل لدينا اختبار المنافسة المستندة إلى CFU على لوحات أجار1،2،سمح لتصور المنافسة خلية واحدة بين V. فيشري يعزل ويتم توفير اقتراحات لتحسين طريقة لمجموعة واسعة من النظم والتجهيزات المجهرية. على الرغم من أن الطريقة الموصوفة هنا تم تحسينها لsymbiont V. fischeriالجهاز الخفيف ، يمكن تعديلها بسهولة لاستيعاب العديد من الميكروبات المتنوعة والطائفية. من المهم ملاحظة أنه يمكن تنظيم الآليات التنافسية من خلال أي عدد من المتغيرات البيئية، بما في ذلك درجة الحرارة والملوحة واللزوجة30و31و32و33و34. وقد أكد العمل السابق أن V. fischeri تتنافس باستخدام نظام إفراز النوع السادس المعتمد على الاتصال الذي ينشط على الأسطح30، مما يجعل الظروف الموصوفة في هذا الفحص مناسبة لدراسة المنافسة بين سلالات المثال. من المهم أيضا النظر في الكثافة الأولية للخلايا على الشريحة عند تحديد المنافسة البكتيرية. وبالنظر إلى أن الاتصال بين الخلايا المستهدفة والمانع غالبا ما يكون مطلوبا لحدوث القتل، ينبغي أن تتركز الثقافة المختلطة بحيث يتم تعظيم الاتصال بين الخلية والخلية وتبقى الخلايا في مستوى واحد على الشريحة. وينبغي زراعة ثقافات الخلايا إلى كثافة بصرية مماثلة (مرحلة منتصف السجل) ومن ثم تركيزها لفرض الاتصال بدلا من مجرد زراعة الثقافات إلى كثافة بصرية أعلى بسبب التغيرات الفسيولوجية للخلايا في مراحل النمو المختلفة. وفي نظم أخرى، قد تحتاج الظروف الثقافية والإعداد التجريبي إلى تعديل لضمان أن الآلية التنافسية نشطة ويمكن اكتشافها في حالة التكون المعدني.
توفر منصات الآغاروز المستخدمة في هذا الفحص العديد من الفوائد: فهي توفر الاستقرار بحيث لا تتحرك الخلايا بحرية ، وتمنع الثقافة من الجفاف على مدار التجربة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا كانت الحث الكيميائية ، مثل isopropyl -β-D-thiogalactoside (IPTG) ، مطلوبة للتجربة ، فيمكن إضافتها بسهولة إلى محلول الآغاروز. ومع ذلك، من المهم أن نلاحظ أن إعداد الآغاروز من المرجح أن تحتاج إلى تعديل لأنظمة مختلفة. في المثال المذكور أعلاه، تم إعداد لوحة الآغاروز عن طريق حل 2٪ agarose (ث / v) إلى 20 psu mPBS، وهي الملوحة القياسية المستخدمة في متوسط نمو V. fischeri. وعلاوة على ذلك، قد يحتاج مصدر الكربون في بعض الحالات إلى إضافته إلى منصة الآغاروز لكي تنمو الخلايا وتتنافس على تجارب أطول. في مثل هذه الحالة، يمكن استبدال mPBS في منصات الآجاروز مع أي وسيلة النمو، على الرغم من أن المواد الغذائية في المتوسط النمو قد تأتي مع مقايضة من مضان الخلفية إضافية.
بدون برامج تحليل الصور الخاصة ، يمكن أن يكون من الصعب جدا الحصول على عدد الخلايا الفردية عندما يكون الاتصال بالخلايا عالية ، وهو ما نطلبه كما نظهر هنا لمراقبة القتل المعتمد على الاتصال. وقد صمم هذا المقايسة لتوفير طريقة بديلة للقياس الكمي لا تعتمد على عدد الخلايا الفردية. بدلا من ذلك، يتم استخدام المساحة الكلية للخلية لكل قناة مضان لتحديد مدى القتل بين السلالات المنقوطة. لأن هذا الأسلوب يعتمد على ناحية بدلا من عدد الخلايا الفردية، إعدادات العتبة الافتراضية عادة ما تكون كافية للخطوط العريضة لمنطقة الخلية الإجمالية. يمكن التحقق من دقة العتبة بقسمة إجمالي مساحة الكائن لحقل عرض تمثيلي على متوسط حجم الخلية للكائن الحي النموذجي ومقارنة رقم الخلية المقدر هذا بعدد خلايا يدوي لنفس الصورة.
في التكبيبات بين مثبط واحد وهدف واحد (غير قاتل) سلالة، ومن المتوقع النمو الصافي للمثبط. وكما رأينا في الشكل 4،قد يكون نمو المثبطات أعلى بكثير في العلاجات التي يلاحظ فيها القتل، مقارنة بالعلاجات التي لا يلاحظ فيها القتل، ربما لأن العناصر الغذائية التي تطلقها الخلايا المستهدفة تسمح لسلالة المثبط بالنمو بسرعة أكبر. في المثال المبين هنا، لوحظ صافي وفيات المستهدفين لأن المنافسة بوساطة T6SS تؤدي إلى تحلل الخلية المستهدفة حيث يتم القضاء على الهدف جسديا. ومع ذلك، من المهم ملاحظة أن الآليات التنافسية لا تؤدي جميعها إلى القضاء المادي على الخلايا المستهدفة. إذا كان الهدف عاجزا بسبب سم يسبب تثبيط النمو ، فقد يؤدي البروتوكول المبين هنا إلى بقاء السكان المستهدفين المرئيين مستقرين بمرور الوقت حيث لم تعد الخلايا المستهدفة تنمو ولكنها لا تنمو أيضا. في مثل هذه الحالة ، سيكون من المناسب مقارنة نتائج هذا الفحص مع اختبارات المتابعة لاستدامة الخلية المستهدفة ، مثل الطلاء لوحدات تشكيل المستعمرة (CFUs) أو عن طريق إجراء فحوصات حية ميتة عن طريق تلطيخ مع يوديد البروبيديوم أو SYTOX الأخضر35،36.
بالمقارنة مع المقايسات coincubation التي تعتمد على التهم CFU، وهذا المقايسة يجعل من الممكن لمراقبة وقياس الهيكل المكاني للمنافسة بين السلالات وتتبع التغيرات في مورفولوجيا الخلية المستهدفة مع مرور الوقت. على سبيل المثال، من المعروف أن الخلايا المثبطة التي تقتل باستخدام T6SS لترميز البروتينات LysM المجال الذي يحط من جدار الخلية المستهدفة، مما أدى إلى تقريب الخلية الأولية ومن ثم تحلل13،والتي لاحظناها في المثال المبين في الشكل 2A. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدام هذا البروتوكول لتتبع المنافسة بدقة عالية على مدى جداول زمنية قصيرة جدا. في المثال المبين هنا، لوحظ انخفاض كبير في المنطقة المستهدفة بعد ساعتين فقط عندما تكون الخلايا مزدحمة ويتم فرض الاتصال بين الخلية الخلية بين السلالات(الشكل 4). كما يمكن إجراء تحليل الصورة الموصوف هنا باستخدام المجهر البؤري، مما يجعل من الممكن دراسة المنافسة البكتيرية في الجسم الحي أو في الأغشية الحيوية المعقدة، دون تعطيل التوزيع المكاني للسلالات المتحللة.
وباختصار، يهدف الفحص الموصوف هنا إلى توفير نهج سهل الوصول إليه وتعديله لتصور وقياس المنافسة البكتيرية على مستوى الخلية الواحدة باستخدام المجهر الفلوري. يمكن تطبيق هذه الطريقة على عزل البكتيريا المتنوعة ويمكن استخدامها لتصور المنافسة البكتيرية حتى في البيئات المعقدة مثل داخل مصفوفة المضيف أو بيو فيلم.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم A.N.S من قبل منحة NIGMS R35 GM137886 وتم دعم S.N.S من قبل برنامج زمالة الدراسات العليا في علوم الدفاع الوطني والهندسة.
Materials
| 1.5 mL Microcentrifuge tube | Fisher | 05-408-129 | |
| 10 uL single channel pipette | |||
| 1000 uL single channel pipette | |||
| 20 uL single channel pipette | |||
| 200 uL single channel pipette | |||
| Agarose | Fisher | BP165-25 | Low melting agarose |
| Calculator | |||
| Cellvis 35 mm Dish | Fisher | NC0409658 | #1.5 cover glass bottom |
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | stock (20 mg/mL in Ethanol); final concentration in media (2 μg /mL LBS) |
| DAPI Nucleic Acid Stain | Fisher | EN62248 | optional (if not using stable plasmids) |
| FIJI image analysis sofware | ImageJ | https://imagej.net/Fiji/Downloads | open-source software |
| Fisherbrand Cover Glasses: Circles | Fisher | 12-545-81P | #1.5 cover glass; 12 mm diameter |
| Kanamycin Sulfate | Fisher | BP906-5 | stock (100 mg/mL in water, filter sterilize); final concentration in media (1 μg/mL LBS) |
| Lens Cleaning Tissue Paper | Fisher | S24530 | |
| Parafilm | Fisher | 13-374-12 | |
| Petri Plates | Fisher | FB0875713 | sterile with lid |
| Razor Blades | Fisher | S65921 | |
| Semi-micro Cuvettes | VWR | 97000-586 | |
| Spectrophotometer | |||
| SYBR Green Nucleic Acid Stain | Fisher | S7563 | optional (if not using stable plasmids) |
| Thermo Scientific Gold Seal Plain Microscope Slides | Fisher | 12-518-100B | |
| Thermo Scientific Richard-Allan Scientific Cover Glass | Fisher | 22-050-235 | #1.5 cover glass, 25 mm2 |
| Type F Immersion Oil | Fisher | NC0297589 | |
| Upright or inverted fluorescence microscope with camera and imaging software | Images in this article were acquired on a Nikon TI-2 inverted fluorescent microscope outfitted with an ORCA-Fusion Digital CMOS camera using NIS-Elements software. | ||
| Vortex | |||
| Water bath | Used to keep agarose warm prior to pipetting | ||
| LBS media | |||
| 1M Tris Buffer (pH ~7.5) | 50 mL 1 M stock buffer (62 mL HCl, 938 mL DI water, 121 g Trizma Base) | ||
| Agar Technical | Fisher | DF0812-17-9 | 15 g (Add only for plates) |
| DI water | 950 mL | ||
| Sodium Chloride | Fisher | S640-3 | 20 g |
| Tryptone | Fisher | BP97265 | 10 g |
| Yeast Extract | Fisher | BP9727-2 | 5 g |
| mPBS (marine PBS) | Phosphate buffered saline with marine salts added; used for making agarose pad | ||
| 10X PBS | Fisher | ICN1960454 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS1-160P | Adjust concentration to appropriate salinity; 20 psu used here |
| Sterile Vacuum Filter Units | Fisher | SCGVU01RE | Used to filter-sterilize mPBS |
| Vacuum pump | Used to filter-sterilize mPBS |
References
- Speare, L., et al. Bacterial symbionts use a type VI secretion system to eliminate competitors in their natural host. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (36), 8528-8537 (2018).
- Speare, L., Septer, A. N. Coincubation assay for quantifying competitive interactions between Vibrio fischeri isolates. Journal of Visualized Experiments. (149), e59759 (2019).
- Frost, I., et al. Cooperation, competition and antibiotic resistance in bacterial colonies. The ISME journal. 12 (6), 1582-1593 (2018).
- Stubbendieck, R. M., Vargas-Bautista, C., Straight, P. D. Bacterial communities: interactions to scale. Frontiers in Microbiology. 7, 1234 (2016).
- Souza, D. P., et al. Bacterial killing via a type IV secretion system. Nature Communications. 6 (1), 1-9 (2015).
- Anderson, M. C., Vonaesch, P., Saffarian, A., Marteyn, B. S., Sansonetti, P. J. Shigella sonnei encodes a functional T6SS used for interbacterial competition and niche occupancy. Cell Host and Microbe. 21 (6), 769-776 (2017).
- Basler, M., Ho, B., Mekalanos, J. Tit-for-tat: Type VI secretion system counterattack during bacterial cell-cell interactions. Cell. 152 (4), 884-894 (2013).
- Guillemette, R., Ushijima, B., Jalan, M., Häse, C. C., Azam, F. Insight into the resilience and susceptibility of marine bacteria to T6SS attack by Vibrio cholerae and Vibrio coralliilyticus. PloS One. 15 (1), 0227864 (2020).
- Hachani, A., Lossi, N. S., Filloux, A. A visual assay to monitor T6SS-mediated bacterial competition. Journal of Visualized Experiments. (73), e50103 (2013).
- Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 15-25 (2010).
- Ruhe, Z. C., Low, D. A., Hayes, C. S. Bacterial contact-dependent growth inhibition. Trends in Microbiology. 21 (5), 230-237 (2013).
- Wood, D. W., Pierson, L. S. The phzI gene of Pseudomonas aureofaciens 30-84 is responsible for the production of a diffusible signal required for phenazine antibiotic production. Gene. 168 (1), 49-53 (1996).
- Smith, W. P., et al. The evolution of the type VI secretion system as a disintegration weapon. PLoS Biology. 18 (5), 3000720 (2020).
- Chen, L., Zou, Y., She, P., Wu, Y. Composition, function, and regulation of T6SS in Pseudomonas aeruginosa. Microbiological Research. 172, 19-25 (2015).
- Sana, T. G., Lugo, K. A., Monack, D. M. T6SS: The bacterial “fight club” in the host gut. PLoS Pathogens. 13 (6), 1006325 (2017).
- Basler, M. Type VI secretion system: secretion by a contractile nanomachine. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 370 (1679), 20150021 (2015).
- Joshi, A., et al. Rules of engagement: the type VI secretion system in Vibrio cholerae. Trends in Microbiology. 25 (4), 267-279 (2017).
- Nadell, C. D., Drescher, K., Foster, K. R. Spatial structure, cooperation and competition in biofilms. Nature Reviews Microbiology. 14 (9), 589-600 (2016).
- Stubbendieck, R. M., Straight, P. D. Multifaceted interfaces of bacterial competition. Journal of Bacteriology. 198 (16), 2145-2155 (2016).
- Septer, A. N. The Vibrio-squid symbiosis as a model for studying interbacterial competition. Msystems. 4 (3), (2019).
- Tischler, A. H., Hodge-Hanson, K. M., Visick, K. L. Vibrio fischeri-squid symbiosis. eLS. , 1-9 (2019).
- Mandel, M. J., Dunn, A. K. Impact and influence of the natural Vibrio-squid symbiosis in understanding bacterial-animal interactions. Frontiers in Microbiology. 7, 1982 (2016).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Boettcher, K., Ruby, E. Depressed light emission by symbiotic Vibrio fischeri of the sepiolid squid Euprymna Scolopes. Journal of Bacteriology. 172 (7), 3701-3706 (1990).
- Doino, J. A., McFall-Ngai, M. J. A transient exposure to symbiosis-competent bacteria induces light organ morphogenesis in the host squid. The Biological Bulletin. 189 (3), 347-355 (1995).
- Dunn, A. K., Millikan, D. S., Adin, D. M., Bose, J. L., Stabb, E. V. New rfp-and pES213-derived tools for analyzing symbiotic Vibrio fischeri reveal patterns of infection and lux expression in situ. Applied and Environmental Microbiology. 72 (1), 802-810 (2006).
- Lambertsen, L., Sternberg, C., Molin, S. Mini-Tn7 transposons for site-specific tagging of bacteria with fluorescent proteins. Environmental Microbiology. 6 (7), 726-732 (2004).
- Koch, B., Jensen, L. E., Nybroe, O. A panel of Tn7-based vectors for insertion of the gfp marker gene or for delivery of cloned DNA into Gram-negative bacteria at a neutral chromosomal site. Journal of Microbiological Methods. 45 (3), 187-195 (2001).
- Peterson, B. W., Sharma, P. K., Van Der Mei, H. C., Busscher, H. J. Bacterial cell surface damage due to centrifugal compaction. Applied and Environmental Microbiology. 78 (1), 120-125 (2012).
- Speare, L., Smith, S., Salvato, F., Kleiner, M., Septer, A. N. Environmental viscosity modulates interbacterial killing during habitat transition. MBio. 11 (1), (2020).
- Salomon, D., Gonzalez, H., Updegraff, B. L., Orth, K. Vibrio parahaemolyticus type VI secretion system 1 is activated in marine conditions to target bacteria, and is differentially regulated from system 2. PloS One. 8 (4), 61086 (2013).
- Sana, T. G., et al. Salmonella Typhimurium utilizes a T6SS-mediated antibacterial weapon to establish in the host gut. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (34), 5044-5051 (2016).
- Bachmann, V., et al. Bile salts modulate the mucin-activated type VI secretion system of pandemic Vibrio cholerae. PLoS Neglected Tropical Diseases. 9 (8), 0004031 (2015).
- Ishikawa, T., et al. Pathoadaptive conditional regulation of the type VI secretion system in Vibrio cholerae O1 strains. Infection and Immunity. 80 (2), 575-584 (2012).
- Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence microscopy methods for determining the viability of bacteria in association with mammalian cells. Journal of Visualized Experiments. (79), e50729 (2013).
- Stiefel, P., Schmidt-Emrich, S., Maniura-Weber, K., Ren, Q. Critical aspects of using bacterial cell viability assays with the fluorophores SYTO9 and propidium iodide. BMC Microbiology. 15 (1), 36 (2015).
