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생화학

Optogenetica bioluminescente 2.0: sfruttare la bioluminescenza per attivare proteine fotosensoriali in vitro e in vivo

Published: August 04, 2021
doi:
10.3791/62850
, , ,
1College of Medicine,Central Michigan University, 2Biochemistry, Cell and Molecular Biology Program,Central Michigan University, 3Neuroscience Program,Central Michigan University

Summary

La bioluminescenza – la luce emessa da un enzima luciferasi che ossida un substrato di piccole molecole, una luciferina – può essere sfruttata per attivare le proteine fotosensoriali, aggiungendo così un’altra dimensione alla stimolazione della luce e consentendo la manipolazione di una moltitudine di funzioni mediate dalla luce nelle cellule attraverso scale temporali e spaziali.

Abstract

La bioluminescenza – luce emessa da un enzima luciferasi che ossida un substrato di una piccola molecola, una luciferina – è stata utilizzata in vitro e in vivo per attivare canali ionici e pompe light-gated nei neuroni. Mentre questo approccio di optogenetica bioluminescente (BL-OG) conferisce una componente chemiogenetica agli strumenti optogenetici, non è limitato all’uso nelle neuroscienze. Piuttosto, la bioluminescenza può essere sfruttata per attivare qualsiasi proteina fotosensoriale, consentendo così la manipolazione di una moltitudine di funzioni mediate dalla luce nelle cellule. Una varietà di coppie luciferasi-luciferina può essere abbinata a proteine fotosensoriali che richiedono diverse lunghezze d’onda di intensità della luce e della luce.

A seconda dell’applicazione specifica, è possibile ottenere un’efficiente erogazione della luce utilizzando proteine di fusione luciferasi-fotorecettore o semplicemente co-trasfezione. Le proteine fotosensoriali basate sulla dimerizzazione dipendente dalla luce o sui cambiamenti conformazionali possono essere guidate dalla bioluminescenza per influenzare i processi cellulari dalla localizzazione delle proteine, alla regolazione delle vie di segnalazione intracellulare alla trascrizione. Il protocollo seguente descrive in dettaglio l’esecuzione sperimentale dell’attivazione della bioluminescenza in cellule e organismi e descrive i risultati utilizzando ricombinasi e fattori di trascrizione guidati dalla bioluminescenza. Il protocollo fornisce agli sperimentatori le procedure di base per l’esecuzione di optogenetica bioluminescente in vitro e in vivo. Gli approcci descritti possono essere ulteriormente estesi e individualizzati a una moltitudine di diversi paradigmi sperimentali.

Introduction

Le proteine fotosensoriali possono essere attivate dalla luce proveniente da una fonte di luce fisica o da un enzima luciferasi in presenza del suo substrato, la luciferina, per generare bioluminescenza. Per le applicazioni che richiedono tempi di milli- o anche femtosecondi e/o risoluzione spaziale a cella singola, le sorgenti luminose fisiche (laser e diodi emettitori di luce (LED)) sono le uniche sintonizzabili su queste scale. Esempi sono la restrizione spaziale della luce utilizzata per stimolare i poli opposti nello sviluppo di larve di Drosophila con controllo temporale al millisecondo1 o la stimolazione precisa di singole strutture subcellulari come i tubuli mitocondriali2. Tuttavia, molte altre applicazioni per gli interruttori ottici hanno priorità diverse, tra cui il controllo spaziale esteso e l’applicazione ripetuta in modo non invasivo e senza danni alla luce, ma con un controllo temporale definito in tempi minuti e intensità sintonizzabili. Qui, l’uso delle luciferasi come fonte di luce alternativa per attivare domini di rilevamento della luce ha diversi vantaggi. A differenza dell’attivazione della luce in fibra ottica, la bioluminescenza raggiunge ogni dominio di rilevamento della luce espresso nella popolazione cellulare target poiché la sorgente luminosa è geneticamente codificata. L’uso della bioluminescenza allevia le preoccupazioni sul danno tissutale e cellulare causato dalle fibre ottiche e dall’esposizione prolungata alla luce fisica. La luce si accende con l’applicazione del substrato di luciferasi. L’esordio è immediato in vitro e in vivo a seconda della via di somministrazione e dura circa 15-30 min; la presenza estesa o la stimolazione fasica della luce può essere ottenuta con diverse luciferine e con applicazioni aggiuntive o ripetute del substrato3. Infine, l’emissione di bioluminescenza può essere regolata variando la concentrazione di luciferina.

L’uso della bioluminescenza per attivare fotorecettori in movimento ionico, cioè elementi optogenetici, come channelrhodopsins o pompe, è stato ampiamente dimostrato4,5,6,7,8. Questo approccio BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) è stato impiegato in esperimenti in vivo su topi e ratti5,6,7,9,10,11,12. L’attivazione BL-OG delle opsine è risultata richiedere una quantità di bioluminescenza di almeno ~33 μW/mm2, con l’aumento dell’efficienza di attivazione con una maggiore emissione luminosa6,9. I fotorecettori sensoriali che muovono ioni sono un sottogruppo del grande contingente di fotorecettori sensoriali trovati in natura che sono non ioni in movimento13,14. L’estensione della bioluminescenza all’attivazione di fotorecettori in movimento non ionici, come i domini fotosensibili di piante o batteri, è incoraggiata da rapporti15,16 secondo cui i fotosensori in movimento non ionici sono significativamente più sensibili alla luce rispetto alle channelrhodopsins, garantendo una guida ancora migliore dei sensori di luce con bioluminescenza rispetto a quelli già ottenuti con elementi optogenetici in movimento ionico. Recentemente, diverse pubblicazioni hanno riportato l’uso della bioluminescenza come fonte di luce per l’attivazione di una varietà di fotorecettori, tra cui domini LOV (light-oxygen-voltage-sensing), domini BLUF (blue-light-using-flavin) e criptocromi (CRY)3,17,18,19,20,21,22 (Tabella 1 ). Le applicazioni per l’attivazione guidata dalla bioluminescenza di interruttori ottici hanno mirato a processi intracellulari che vanno dalla morte cellulare indotta da specie reattive dell’ossigeno, alla sintesi di cAMP, al reclutamento e dissociazione proteica alla ricombinazione genomica e all’induzione della trascrizione.

Questo protocollo delinea la progettazione generale degli strumenti optogenetici guidati dalla bioluminescenza e descrive in dettaglio le procedure per l’esecuzione sperimentale dell’attivazione della bioluminescenza in cellule e organismi. Include descrizioni su come allestire una stanza, una cappa per la coltura dei tessuti e un’incubatrice e un microscopio per lavorare con la bioluminescenza, nonché i passaggi dalla preparazione della luciferina all’applicazione. Questo protocollo fornisce agli sperimentatori le procedure di base per l’esecuzione di BioLuminescent OptoGenetics (BL-OG) in vitro e in vivo. Gli approcci descritti possono essere ulteriormente estesi e individualizzati a diversi paradigmi sperimentali. Prevediamo questo protocollo per facilitare l’adozione dell’uso della bioluminescenza negli studi biologici optogenetici.

Protocol

Tutte le procedure del presente studio sono state eseguite utilizzando i protocolli approvati dall’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) per la manipolazione degli animali presso la Central Michigan University, MI. 1. Attivazione della bioluminescenza di proteine fotosensoriali in vitro Costrutti Selezionare una sequenza di luciferasi o una sequenza di fusione proteica luciferasi-fluorescente che si tradurrà nell’espressione di un emettitore di luce che produce luce di una lunghezza d’onda corrispondente al fotorecettore da attivare.NOTA: Ad esempio, le luciferasi che emettono luce blu, come le varianti della Gaussia luciferasi o NanoLuc, possono essere abbinate a fotorecettori con rilevamento della luce blu come CRY/Ca2+ e proteina legante l’integrina (CIB), LOV o Vivid (VVD). Se non è già disponibile da altri ricercatori o depositi di plasmidi, utilizzare tecniche standard di biologia molecolare per clonare il DNA in un plasmide di espressione dei mammiferi.NOTA: La scelta dei promotori è dettata dalla necessità di fornire un’espressione forte e costitutiva del modulo di emissione luminosa, come quella fornita dai promotori CAG e CMV. Per gli studi iniziali, utilizzare plasmidi separati per la co-trasfezione dell’emettitore di luce e del sensore di luce. Generare proteine di fusione delle due parti secondo necessità e per studi successivi. Ottieni DNA plasmidici di alta qualità utilizzando kit mini-, midi o maxiprep secondo i protocolli del produttore. Coltura cellulare e trasfezioneNOTA: le celle HeLa e HEK293 vengono utilizzate come esempi in questo protocollo. Celle a piastre in formati e numeri in base all’uso finale desiderato.NOTA: esempi specifici sono riportati nella Tabella 2. La densità cellulare al momento della placcatura determinerà quanto presto le cellule possono essere trasfettate. Per valutare la trascrizione attivata dalla bioluminescenza mediante microscopia a fluorescenza, le cellule della piastra HEK293 su coverslip da 12 mm rivestite in poli-D-lisina (PDL) sono collocate in piastre a 24 pozzetti. Per valutare la trascrizione attivata dalla bioluminescenza misurando l’emissione luminosa da una reporter luciferasi ortogonale in un luminometro, placcare le cellule HeLa inizialmente in piastre a 6 o 12 pozzetti per la trasfezione, ma ri-placcarle dopo la trasfezione (vedere il passaggio 4). Se la stimolazione ripetuta della bioluminescenza verrà effettuata in camere di imaging a cellule vive, selezionare i coverslip delle dimensioni appropriate e posizionarli in piastre multi-pozzetto della dimensione appropriata (piastre a 24 pozzetti per coverslip da 12 mm; piastre a 12 pozzetti per coverslip da 15 mm e 18 mm). Semina le celle sopra i coverslip utilizzando i numeri di cella specificati nella Tabella 2. Se il tipo di cellula selezionato non aderisce bene alla superficie di coltura, placcare le cellule su piatti rivestiti con PDL. Eseguire la trasfezione mediante lipofezione secondo la raccomandazione del produttore o utilizzare qualsiasi metodo di trasfezione appropriato per il tipo di cellula selezionato.NOTA: La Tabella 3 descrive gli esperimenti di trasfezione per due diversi fotorecettori, EL222 e CRY2/CIB, e i rispettivi plasmidi reporter, oltre a diverse proteine che emettono luce. I rapporti dei vari plasmidi funzionano bene per gli esempi selezionati ma dovranno essere ottimizzati per ogni coppia emettitore di luce/sensore di luce. Dopo la trasfezione, posizionare le cellule in un’incubatrice completamente sigillata alla luce (Figura 1). A seconda dell’uso finale desiderato, utilizzare le cellule per la stimolazione della bioluminescenza il giorno successivo nei loro pozzetti / piatti originali o ripiazionarle 3-4 ore dopo la lipofezione. Per leggere la trascrizione di un gene reporter della luciferasi della lucciola in un luminometro, ri-placcare le cellule in piastre bianche a 96 pozzetti.NOTA: eseguire tutte le manipolazioni in una stanza a tenuta di luce in una cappa a flusso laminare illuminata da luce rossa (Figura 2). Lavare le cellule trasfettate una volta con il mezzo Eagle modificato (DMEM) di Dulbecco o la soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). Aggiungere il volume minimo di un reagente tripsinizzante ai pozzetti (24 pozzetti: 100 μL; 12 pozzetti: 150 μL; 6 pozzetti: 300 μL) e incubare le cellule per 3 minuti a 37 °C. Aggiungere il terreno di coltura per ottenere una concentrazione cellulare che produrrà la densità cellulare appropriata per la fase successiva di placcatura (ad esempio, riutilizzare le cellule in un 24 pozzetti in un volume finale di 1,2 ml per la placcatura in 10 pozzetti di una piastra a 96 pozzetti; risospese le cellule in un 12 pozzetti in un volume finale di 2,4 ml per la placcatura in 20 pozzetti di una piastra da 96 pozzetti). Raggruppare le cellule trasfettate da diversi pozzi a seconda del numero di pozzi necessari alla fine. Placcare le cellule trasfettate nel loro formato finale e restituire le piastre all’incubatore protetto dalla luce. Attivazione della bioluminescenza in vitro Preparare il substrato della luciferasi (luciferina). Preparare 50 mM di scorte sciogliendo 5 mg di celelenterazina liofilizzata (CTZ) in 250 μL del suo solvente specifico. Assicurarsi che tutto il CTZ lungo le pareti del flaconcino sia sciolto mediante pipettaggio o vortice. Proteggere il flaconcino dalla luce diretta. Preparare aliquote da 50 μL in tubi microcentrifuga neri da 0,5 mL e conservare a -80 °C per un uso futuro.NOTA: il CTZ disciolto in solvente non congela a -80 °C. Le aliquote possono essere rimosse e restituite più volte al congelatore per realizzare soluzioni di lavoro purché l’esposizione alla luce e alla temperatura ambiente sia ridotta al minimo. Stimolazione della luce a bioluminescenza singolaNOTA: Tutte le manipolazioni vengono eseguite in una stanza a tenuta di luce in una cappa a flusso laminare illuminata da luce rossa (Figura 2). Preparare una soluzione di lavoro di luciferina in terreno di coltura cellulare (DMEM o NeuroBasal). Regolare la concentrazione della luciferina in modo tale che la concentrazione finale sia di 100 μM. Preparare tutte le diluizioni di CTZ in mezzo poco prima di aggiungere alle cellule, poiché CTZ si ossida nel tempo.NOTA: se l’intero volume del mezzo verrà sostituito, la soluzione di lavoro sarà di 100 μM. Se il mezzo contenente luciferina viene aggiunto alle cellule, la concentrazione sarà maggiore del fattore di diluizione (ad esempio, l’aggiunta di 50 μL di mezzo contenente 300 μM di luciferina a 100 μL di mezzo nel pozzo comporterà una diluizione 1:3 e quindi una concentrazione finale di 100 μM di luciferina). Aggiungere il mezzo contenente luciferina alle cellule e incubare per la durata desiderata della stimolazione luminosa.NOTA: questo può essere breve come 1 minuto o lungo fino a 15 minuti e potrebbe essere ancora più breve o più lungo. Il periodo di tempo per lasciare il mezzo contenente luciferina sulle cellule dipende dall’emivita e dalla cinetica della combinazione luciferasi-luciferina selezionata. Monitorare l’emissione luminosa a 100 μM di concentrazione finale di luciferina ad occhio dopo aver spento la luce rossa; attendere qualche secondo fino a quando gli occhi non si sono adattati alla completa oscurità. Documentare l’emissione luminosa scattando una fotografia (anche con un telefono cellulare). Terminare la stimolazione luminosa rimuovendo il mezzo contenente luciferina e sostituendolo con il mezzo di coltura. A seconda della sensibilità degli esperimenti, lavare le cellule con terreno di coltura una o due volte dopo aver rimosso il mezzo contenente luciferina per eliminare tutta la luciferina. Se le cellule non aderiscono bene alla superficie di coltura, placcarle su piatti rivestiti di PDL per evitare di perdere le cellule durante i lavaggi. Riportare le cellule all’incubatore protetto dalla luce per 16-24 ore. Stimolazione ripetuta della luce a bioluminescenzaNOTA: Tutte le manipolazioni vengono eseguite in una stanza che può essere resa a tenuta di luce ed essere illuminata da luce rossa. Impostare la camera di imaging live-cell. Creare un compartimento a tenuta di luce attorno al microscopio di imaging a cellule vive utilizzando una scatola e fogli di plastica neri o tende nere (Figura 3). Coprire tutte le sorgenti luminose presenti all’interno del compartimento a tenuta di luce e della stanza (ad esempio, indicatori LED sul microscopio o strumenti). Impostare il sistema di perfusione con la soluzione desiderata per l’aspirazione e l’outport della camera che porta a un contenitore per i rifiuti.NOTA: Ad esempio, la soluzione di imaging può essere la soluzione di Tyrode (cloruro di sodio (124 mM), cloruro di potassio (3 mM), HEPES (10 mM), cloruro di calcio diidrato (2 mM), cloruro di magnesio esaidrato (1 mM), D-glucosio (20 mM)). Preparare una soluzione di lavoro di luciferina nella soluzione di imaging. Aliquota in tanti tubi di microcentrifuga quanti sono le stimolazioni ripetute. Regolare la concentrazione della luciferina in modo tale che la concentrazione finale nella camera di imaging sia di 100 μM. Posizionare un coverslip con cellule trasfettate nella camera. Mantenendo la pompa in funzione, rimuovere il tubo di ingresso della pompa dal becher di aspirazione e immergerlo rapidamente nella soluzione di luciferina, mantenendo il tempo di transizione il più breve possibile per evitare qualsiasi vuoto d’aria nel tubo. Non appena la soluzione di luciferina è stata assorbita, riposizionare il tubo di ingresso nel becher di aspirazione. Ripetere questo processo tutte le volte che è necessario e ad intervalli di diversi minuti o ore, a seconda del modello fisiologico a cui le cellule dovrebbero essere esposte. Riportare le cellule all’incubatore protetto dalla luce per 16-24 ore per la trascrizione, o per il periodo di tempo in cui deve essere valutato l’effetto della stimolazione luminosa. 2. Attivazione della bioluminescenza delle proteine fotosensoriali in vivo Costrutti Selezionare una sequenza di luciferasi o una sequenza di fusione proteica luciferasi-fluorescente che si tradurrà nell’espressione di un emettitore di luce che produce luce di una lunghezza d’onda corrispondente al fotorecettore da attivare. Utilizzare tecniche standard di biologia molecolare per clonare il DNA in un plasmide pAAV, se non già disponibile da altri ricercatori o depositi di plasmidi. Scegli promotori forti per l’espressione dei moduli che emettono luce, come CAG o CMV. Utilizzare approcci standard per preparare scorte virali ad alto titolo6 o preparare commercialmente vettori virali. Per gli studi iniziali, utilizzare vettori virali separati per la co-trasduzione dell’emettitore di luce e del sensore di luce per consentire la regolazione dei rapporti dei diversi componenti, se necessario. Trasduzione AAV Iniettare nell’organo bersaglio dell’animale sperimentale vettori virali dell’emettitore di luce, del sensore di luce e del reporter analoghi ai rapporti di concentrazione utilizzati per le trasfezioni in vitro (Tabella 3). Riportare gli animali nelle loro gabbie domestiche per almeno 2 settimane per consentire la massima espressione di tutti i componenti.NOTA: Se l’organo bersaglio si trova all’interno del corpo e protetto dalla luce ambientale, gli animali possono essere alloggiati in condizioni di luce normali. Attivazione della bioluminescenza in vivo Preparare il substrato della luciferasi (luciferina). Estrarre un flaconcino di CTZ solubile in acqua dal congelatore a -80 °C e lasciarlo scaldare a temperatura ambiente. Tenerlo al riparo dalla luce. Per flaconcino da 500 μg, aggiungere 250 μL di acqua sterile, usando una siringa o aprendo il flaconcino e aggiungendo acqua con una pipetta, quindi rimettendo il tappo di gomma sul flaconcino di vetro. Incubare il flaconcino di vetro ricostituito a bagnomaria a 55 °C per alcuni minuti per sciogliere completamente la polvere. Trasferire la soluzione in un tubo microcentrifuga nero. Risciacquare le pareti del flaconcino di vetro per recuperare tutto il CTZ. Rimuovere la quantità di soluzione necessaria per il giorno. Conservare la soluzione rimanente a 4 °C per l’uso il giorno successivo. Non congelare! Eseguire le stesse operazioni (2.3.1.1.-2.3.1.5) per un flaconcino di veicolo. Stimolazione della luce a bioluminescenza Rimuovere il volume di luciferina/veicolo necessario per le dimensioni dell’animale e la via di applicazione scelta (Tabella 4). Iniettare gli animali con luciferina o veicolo. Ripetere la stimolazione della luce a bioluminescenza secondo il disegno sperimentale. Ad esempio, se si desidera l’attivazione di una ricombinasi durante uno specifico paradigma comportamentale, iniettare gli animali appena prima del test comportamentale. Se la trascrizione fasica di una molecola è l’obiettivo, iniettare ripetutamente gli animali per giorni. Raccogliere dati dagli animali stimolati dalla bioluminescenza come progettato.

Representative Results

Ci sono numerosi eventi intracellulari che possono essere manipolati con attuatori che rispondono alla luce e che sono suscettibili di attivazione bimodale con sorgenti luminose fisiche e biologiche. Di seguito sono riportati esempi che impiegano un integratore di calcio fotoensizzante (Ca2 +), traslocazione proteica indotta dalla luce, un fattore di trascrizione sensibile alla luce e una ricombinasi fotosensibile. Gli esempi illustrano la fattibilità dell’utilizzo della bioluminescenza per attivare vari tipi di fotorecettori. Gli esperimenti presentati non sono stati specificamente ottimizzati per quanto riguarda l’applicazione del diodo emettitore di luce (LED), la luciferasi scelta, o rispetto alle concentrazioni e ai tempi di applicazione della luciferina. L’espressione rapida regolata dalla luce e dall’attività (FLARE) è un sistema optogenetico che consente la trascrizione di un gene reporter con la coincidenza di un aumento intracellulare di Ca2+ e luce23 (Figura 4A). La presenza di Ca2+ è necessaria per portare la proteasi in prossimità del sito di scissione della proteasi accessibile solo con stimolazione luminosa, con conseguente rilascio del fattore di trascrizione. Le cellule HEK293 sono state co-trasfettate con i componenti flare originali, un doppio costrutto reporter Firefly (FLuc)-dTomato e una variante di Gaussia luciferasi ancorata alla membrana sbGLuc6. In presenza di un aumento del Ca2+ intracellulare attraverso l’esposizione delle cellule a 2 μM di ionomicina e 5 mM di cloruro di calcio (CaCl2), l’applicazione di LED blu ha portato a una robusta espressione del reporter di fluorescenza rispetto alle cellule lasciate al buio, nonché all’espressione di FLuc determinata misurando la luminescenza all’aggiunta del substrato FLuc, D-luciferina. Livelli simili di espressione di FLuc sono stati raggiunti con la bioluminescenza emessa da sbGLuc all’applicazione del substrato sbGLuc (CTZ) insieme a ionomicina e CaCl2. Si noti che le luciferasi utilizzate per l’attivazione della luce (sbGLuc) e per riportare l’effetto dell’attivazione della luce (trascrizione di FLuc) producono luce solo con le rispettive luciferine (CTZ vs. D-luciferina) e non reagiscono in modo incrociato. Diversi componenti sono stati combinati per generare un sistema di trascrizione indotta dalla luce basato sull’eterodimerizzazione dei criptocromi23,24 (Figura 4B). CRY2 è stato fuso con una proteasi mentre il CIB legato alla membrana è stato fuso al sito di scissione della proteasi e al fattore di trascrizione. La traslocazione proteica indotta dalla luce ha rilasciato il fattore di trascrizione, portando all’espressione di FLuc e dTomato, come mostrato nella Figura 4A. Mentre la presenza del solo componente del fattore di trascrizione ha provocato un notevole segnale di fondo probabilmente dovuto alla proteolisi spontanea, sia la luce fisica (LED) che la bioluminescenza (CTZ) hanno aumentato in modo robusto l’espressione di FLuc misurata in un sistema di imaging in vivo (IVIS). In un’altra serie di esperimenti, NanoLuc (luciferina: furimazina o hCTZ) è stato impiegato per la regolazione optogenetica della trascrizione attraverso la dimerizzazione di CRY/CIB e il fattore di trascrizione fotosensibile, EL22225,26,27. La Figura 5A,B mostra gli schemi dei diversi componenti negli stati buio e luce e la luciferasi co-trasfettate o fuse al sensore di luce. Vari confronti sono mostrati nella Figura 5C. La bioluminescenza, indotta dall’aggiunta di hCTZ alle celle HEK293 che esprimono i costrutti e rimuovendoli dopo 15 minuti, è stata più efficiente nel guidare la trascrizione del reporter rispetto a 20 minuti di esposizione alla luce LED sia per CRY / CIB che per EL222. Per CRY/CIB, un’ora di esposizione ai LED è stata sufficiente per raggiungere un livello di trascrizione paragonabile a 15 minuti di bioluminescenza. Al contrario, per EL222, anche 60 minuti di LED erano a malapena la metà più efficaci di una breve esposizione alla bioluminescenza. Non ci sono state differenze significative nell’efficacia della trascrizione tra i due sistemi quando co-trasfettati, sebbene le proteine di fusione di CRY/CIB fossero più efficienti di quelle di EL222. Per entrambi i sistemi, le proteine di fusione hanno portato a livelli di trascrizione significativamente più elevati rispetto ai componenti co-trasfettati. CRY/CIB ha mostrato livelli di background costantemente più elevati con l’applicazione del veicolo rispetto a EL222, che aveva una trascrizione di fondo trascurabile. L’aumento delle concentrazioni di hCTZ da solo non ha avuto alcun effetto sulla trascrizione del gene reporter. Le ricombinasi fotoattivabili forniscono uno strumento versatile per le manipolazioni optogenomiche. Abbiamo testato l’attivazione della bioluminescenza di una crecombinasi divisa fotosensibile basata sulla proteina Vivid LOV, iCreV28. La Figura 6A mostra uno schema dei diversi componenti, sbGLuc, iCreV e un reporter di fluorescenza lox-stop-lox (tdTomato) prima e dopo l’applicazione di CTZ. I risultati dell’applicazione CTZ relativi ai controlli (senza CTZ o LED) sono mostrati nella Figura 6B. C’è qualche espressione di sfondo anche al buio (nessun CTZ); tuttavia, in presenza di CTZ, l’espressione è robustamente aumentata sullo sfondo e simile a quella indotta con l’applicazione LED. Figura 1: Incubatore a tenuta di luce. Patta della scatola di cartone che copre la luce dal pannello di controllo illuminato (freccia in alto). Coperchio impermeabile alla luce sopra la porta a vetri dell’incubatore (freccia inferiore) per proteggere le cellule dall’esposizione alla luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 2: Cappa a flusso laminare illuminata da luce rossa. Configurazione che mostra una cappa di coltura di tessuto a flusso laminare standard illuminata da luce rossa. La freccia indica una lampada da tavolo standard con una lampadina rossa. Tutte le manipolazioni sotto la luce rossa vengono eseguite in una stanza altrimenti buia e a tenuta di luce. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 3: Compartimenti a tenuta di luce attorno ai microscopi per immagini a cellule vive. Due esempi di configurazioni di microscopi per immagini a cellule vive che mostrano l’uso di una scatola solida con tende di plastica solo sul lato anteriore (pannelli di sinistra: superiore e inferiore) o tende nere intorno alla configurazione di imaging (pannelli di destra: superiore e inferiore). I lati anteriori in entrambi gli esempi rimangono aperti e arrotolati quando non sono in uso (pannelli superiori: sinistro e destro). Le tende nere anteriori sono arrotolate verso il basso per impedire alla luce nella stanza (ad esempio, schermi di computer) di entrare nell’area di imaging durante l’esecuzione di stimolazione e / o imaging a bioluminescenza di cellule vive (pannelli inferiori: sinistra e destra). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 4: Bioluminescenza per l’integrazione di eventi di segnalazione intracellulare. (A) Schemi dei componenti FLARE co-trasfettati con sbGLuc. In presenza di Ca2+ e la conseguente vicinanza della proteasi al sito di scissione della proteasi, la bioluminescenza o il LED porteranno allo spiegamento di LOV, all’esposizione del sito di scissione e al rilascio del fattore di trascrizione. Le celle sono state esposte a LED (duty cycle 33%, 2 s on/4 s off per 40 min; potenza luminosa 3,5 mW, irraggiamento 4,72 mW/cm2 ) o a bioluminescenza (concentrazione finale CTZ 100 μM per 15 min) o lasciate al buio. Immagini microscopiche di cellule HEK293 che esprimono i componenti di cui sopra dopo il trattamento per aumentare i livelli di Ca2+ e l’esposizione ai LED (a sinistra). Luminescenza FLuc misurata in un luminometro confrontando l’esposizione a LED, bioluminescenza (CTZ) o sinistra al buio (destra). (B) Schemi di un sistema di trascrizione non-Ca2+-dipendente co-trasfettato con sbGLuc. Le cellule HEK293 in piastre a 4 pozzetti sono state trasfettate con quattro diverse disposizioni di componenti come raffigurato nello schematico. Le piastre sono state esposte a LED (ciclo di lavoro 33%, 2 s on/4 s off per 40 min; potenza luminosa 3,5 mW, irraggiamento 4,72 mW/cm2 ) o bioluminescenza (concentrazione finale CTZ 100 μM) aggiungendo CTZ e lasciandolo acceso per 15 min; le piastre di controllo sono state lasciate al buio. La trascrizione del reporter FLuc è stata misurata in un IVIS. Le immagini IVIS dei piatti rappresentativi sono mostrate sulla sinistra; Le misurazioni della radianza da diverse repliche di base ai controlli scuri sono mostrate a destra. Barra della scala = 100 μm. Abbreviazioni: FLARE = Espressione veloce regolata dalla luce e dall’attività; LOV = luce-ossigeno-tensione-sensing; LED = diodo emettitore di luce; CTZ = celenterazina; FLuc = lucciola luciferasi; dTom = dTomato; CRY2 = criptocromo 2; CRY2PHR = CRY2 regione di omologia della fotoliasi; CIB1 = Ca2+- e proteina legante l’integrina 1; CIBN = N-terminus di CIB1; IVIS = sistema di imaging in vivo . Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 5: Bioluminescenza per guidare la trascrizione. (A) Schemi di due sistemi di trascrizione fotoattivabili nei loro stati di buio e luce. (B) NanoLuc è stato co-trasfettato o fuso alle parti sensibili alla luce come raffigurato (N-NanoLuc-CRY-GalDD-C; N-NanoLuc-VP16-EL222-C). (C) Confronti utilizzando entrambi i sistemi per quanto riguarda le sorgenti luminose, la progettazione dei costrutti e il segnale al rumore. Le celle sono state esposte a LED (ciclo di lavoro 33%, 2 s on/4 s off per 40 min; potenza luminosa 3,5 mW, irraggiamento 4,72 mW/cm2 ) o a bioluminescenza per 15 min (concentrazione finale hCTZ 100 μM; tranne dove si notano concentrazioni diverse). Scure, le placche sono state lasciate intatte nell’incubatrice tra la trasformazione iniziale dei plasmidi e la misurazione FLuc; VEH, le targhe sono state gestite allo stesso modo di quelle che ricevono hCTZ, ma hanno ricevuto invece il veicolo. Differenze nei livelli di trascrizione: hCTZ, CRY co-trasfettato vs. EL222 – non significativo; hCTZ, luciferasi – fusione fotoproteica CRY vs. EL222 – p < 0,005; hCTZ, cry co-trasfezione vs fusione – p < 0,005; hCTZ, CO-trasfezione EL222 vs fusione – p < 0,01; veicolo, CRY vs. EL222 – p < 0,05. Abbreviazioni: UAS = sequenza di attivazione a monte; LED = diodo emettitore di luce; CTZ = celenterazina; FLuc = lucciola luciferasi; CRY = criptocromo; CIB = Ca2+- e proteina legante l’integrina; VEH = veicolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Figura 6: Bioluminescenza per la manipolazione optogenomica. (A) Schemi di manipolazione optogenomica guidata dalla bioluminescenza utilizzando sbGLuc, i componenti iCreV divisi e una cassetta reporter LSL, prima e dopo l’applicazione della luce. (B) Le cellule HEK293 sono state lipofettate con plasmidi, quindi tenute al buio. Ventiquattro ore dopo, le celle sono state trattate per 30 minuti con solo medio (senza CTZ) o con CTZ (concentrazione finale di 100 μM) o con LED (duty cycle 25%, 5 s on/15 s off per 5 min; 14,81 mW di potenza luminosa, 20 mW/cm2 di irraggiamento) come controllo positivo. Immagini microscopiche della fluorescenza tdTomato utilizzando condizioni come indicato. Barra della scala = 100 μm. Abbreviazioni: LSL = lox-stop-lox; CTZ = celenterazina; LED = diodo emettitore di luce; VVD = Vivido. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura. Tabella 1: Attivazione della bioluminescenza dei fotorecettori. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 2: Linee guida per la placcatura e la trasfezione di cellule in diversi formati. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 3: Rapporti di vari plasmidi per la trasfezione. Fare clic qui per scaricare questa tabella. Tabella 4: Vie di iniezione, volumi e concentrazioni di luciferina per applicazioni in vivo (25 g di topo). Fare clic qui per scaricare questa tabella.

Discussion

Esiste una gamma di luciferasi e luciferine con lunghezze d’onda di emissione luminosa corrispondenti agli spettri di attivazione delle proteine fotosensoriali dalla luce blu a quella rossa14,29. Oltre ad allineare le lunghezze d’onda di emissione ed eccitazione, non esiste un modo affidabile per determinare a priori quale accoppiamento funzionerà meglio. Pertanto, la necessità di determinare sperimentalmente come le coppie luciferina-luciferasi funzionano nelle cellule e negli organismi nel guidare i sistemi fotosensoriali.

I protocolli delineati in questa presentazione descrivono come preparare la luciferina e come applicarla in vitro e in vivo, insieme alle linee guida sulla creazione di stanze, cappe di coltura tissutale, incubatori e microscopi per esperimenti che utilizzano la bioluminescenza. Negli esperimenti rappresentativi, sono state utilizzate diverse luciferasi (NanoLuc, Gaussia luciferasi) con diverse proteine fotosensoriali (CRY / CIB, EL222, VVD, LOV), dimostrando gli effetti della bioluminescenza rispetto alla luce fisica, co-trasfezione rispetto alle proteine di fusione, confronti segnale-rumore e diversi saggi di lettura. Altre applicazioni delle proteine fotosensoriali che attivano la bioluminescenza sono descritte in pubblicazioni di diversi gruppi, mirate all’induzione della morte cellulare, alla sintesi di cAMP e al movimento proteico oltre alla trascrizione (Tabella 1).

La semplice co-trasfezione di componenti che emettono luce e che rilevano la luce è un buon inizio. Le variabili sono i rapporti molari di emettitore e sensore; le incognite sono i livelli di fondo dell’attività del sensore al buio, l’attività del sensore in relazione all’intensità e alla durata della luce e l’efficienza dell’attivazione del sensore confrontando la luce fisica e biologica. Mentre i costrutti di fusione hanno il vantaggio di mantenere il rapporto molare di emettitore e sensore a 1:1 e di avvicinare l’emettitore di luce al dominio di rilevamento della luce, entrano in gioco altre considerazioni, come dove legare (N- o C-terminus) e come collegare (lunghezza e composizione del linker) senza influire sulle prestazioni dell’attuatore fotosensoriale.

Per gli esperimenti sia in vitro che in vivo, ci sono diverse opzioni per sintonizzare l’emissione di luce bioluminescente, variando la concentrazione della luciferina e/o variando il tempo in cui la luciferina viene resa disponibile al rispettivo sensore. La quantità minima e il tempo sono determinati dalla presenza o dall’assenza dell’effetto previsto con l’attivazione della luce. Al contrario, i rispettivi massimi sono determinati principalmente dalla tolleranza delle cellule ad alte concentrazioni di luciferina per tempi prolungati. La concentrazione di CTZ scelta negli esempi precedenti, 100 μM, è vicina al limite superiore per vari tipi di cellule, dalle cellule HEK293 ai neuroni. L’obiettivo è quello di utilizzare una concentrazione il più bassa possibile per il minor tempo possibile per ottenere l’attivazione del dominio di fotoensing mirato. Ciò sarà ottenuto più facilmente utilizzando luciferasi con elevata emissione luminosa e fotorecettori con elevata sensibilità alla luce.

La bioluminescenza per la guida di fotorecettori è stata utilizzata nei roditori (topi, ratti) con proteine fotosensibili espresse nel fegato, nei muscoli, nel midollo spinale e nel cervello, nonché tramite cellule che esprimono fotorecettori trapiantate per via sottocutanea o intraperitoneale. In linea di principio, non ci sono limiti che impediscano che l’approccio venga applicato a specie diverse, dai primati non umani ai pesci o alle mosche. A seconda della permeabilità dell’organismo per la luciferina, l’applicazione può essere facile come applicare la luciferina all’acqua circostante (ad esempio, nelle larve di pesce30). Prima di utilizzare BL-OG in qualsiasi nuovo organismo, devono essere condotti esperimenti pilota per garantire che la luciferina raggiunga i suoi obiettivi attraverso la via di applicazione scelta.

Aspetti critici del progetto sperimentale sono i vari controlli che sono importanti per l’interpretazione dei risultati. Le cellule che esprimono un reporter guidato da una luciferasi che agisce su una proteina fotosensoriale dovrebbero essere confrontate con cellule prive della luciferasi o prive della proteina fotosensoriale. Inoltre, i confronti dovrebbero essere fatti tra le cellule esposte alla luciferina, al veicolo o tenute al buio. È anche importante rendersi conto dei limiti dei diversi saggi per valutare gli effetti dell’attivazione dei fotorecettori guidata dalla bioluminescenza. Ad esempio, l’efficacia della trascrizione attivata dalla bioluminescenza può essere testata in diversi modi, a seconda che il gene reporter sia una luciferasi ortogonale (luminometro, IVIS) o una proteina fluorescente (selezione cellulare attivata dalla fluorescenza, analisi delle immagini al microscopio). Mentre gli effetti di base dovrebbero essere riproducibili su tutte le piattaforme di test, gli aspetti quantitativi degli effetti potrebbero variare considerevolmente.

L’attivazione della bioluminescenza dei fotorecettori è stata dimostrata finora per un numero limitato di luciferasi e proteine fotosensoriali, rispettivamente, sia in vitro che in vivo. Può essere esteso alla grande classe di fotorecettori per attivare molti più processi biologici. Tale espansione dell’approccio è ulteriormente promossa dal continuo sviluppo di nuove coppie di luciferasi e proteine luciferasi-fluorescenza con emissione luminosa molto più elevata rispetto alle luciferasi presenti in natura e con caratteristiche cinetiche sintonizzabili a diverse applicazioni. Questi progressi sono paralleli alla generazione di nuove luciferine, aggiungendo ulteriormente una maggiore luminosità e tavolozze di colori29. Questa piattaforma di strumenti offre applicazioni per manipolare e studiare le dinamiche intracellulari e le interazioni cellulari all’interno di cellule, tessuti e organismi viventi.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ringraziamo i nostri colleghi per i costrutti, in particolare A. Ting per la proteasi Ca-FLARE, il fattore di trascrizione e il reporter (Addgene # 92214, 92213, 92202), H. Kwon per TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 e NES-CRY2PHR-TevC (Addgene # 89878, 89877), C. Tucker per CRY-GalΔDD (B1013) e CIB-VP64 (B1016) (Addgene # 92035, 92037), M. Walsh per pGL2-GAL4-UAS-Luc (Addgene #33020), K. Gardner per VP-EL222 e C120-Fluc, e A. Cetin e H. Zeng per aver reso disponibile iCreV prima della pubblicazione. Questo lavoro è stato supportato da sovvenzioni di NSF (NeuroNex 1707352), NIH (U01NS099709), W.M. Keck Foundation e Swedish Research Council ad A.B. (2016-06760).

Materials

ABI 25W Deep Red 660 nm LED Light Bulb Amazon to be used with any lamp stand
 Black Microcentrifuge Tubes, 0.5 mL, Argos Technologies Fisher Scientific 03-391-166
Black Microcentrifuge Tubes, 1.5 mL, Argos Technologies Fisher Scientific 03-391-161
Black Nylon, Polyurethane-Coated Fabric (1.5 m x 2.7 m) x 0.12 mm (thick) THOR LABS BK-5
C120-Fluc K. Gardner
CaCl2 Sigma C8106; CAS: 10035-04-8
Ca-FLARE protease, transcription factor and reporter Addgene # 92214, 92213, 92202 A. Ting
CIB-VP64 (B1016) Addgene # 92037 C. Tucker
CRY-GalΔDD (B1013) Addgene # 92035 C. Tucker
CTZ Prolume Inc. (NanoLight) 303 formulation for in vitro applications with Gaussia luciferases
CTZ (Water soluble native coelenterazine) Prolume Inc. (NanoLight) 3031 formulation for in vivo applications with Gaussia luciferases
D-(+)-Glucose Sigma G8270; CAS: 50-99-7
D-Luciferin, Potassium Salt Gold Biotechnology LUCK
DMEM Thermo Fisher 11960044
D-PBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher 14190144
hCTZ Prolume Inc. (NanoLight) 301 formulation for in vitro applications with Oplophorus luciferases
HEK293 ATCC CRL-1573
HeLa ATCC CCL-2
HEPES Sigma H3375; CAS: 7365-45-9
iCreV A. Cetin and H. Zeng
In Vivo Imaging System (IVIS) Perkin-Elmer Lumina LT
KCl Sigma P5405; CAS: 7447-40-7
LED Array Driver Amuza LAD-1
LED Array for Multiwell Plates Amuza LEDA-x
Lipofectamine 2000 Reagent Invitrogen 11668-019 Transfection reagent
Luminometer Molecular Devices SpectraMax L
MgCl2 Hexahydrate Sigma M2670; CAS: 7791-18-6
NaCl Sigma S7653; CAS: 7647-14-5
NanoFuel Solvent Prolume Inc. (NanoLight) 399 for dissolving CTZ preparations for in vitro use
NaOH Sigma 221465; CAS: 1310-73-2
NES-CRY2PHR-TevC Addgene # 89877 H. Kwon
Opti-MEM Thermo Fisher 11058021 transfection medium
PDL coated coverslips (12 mm, 15 mm, 18 mm) Neuvitro Corporation GG-12-PDL, GG-15-PDL , GG-18-PDL
pGL2-GAL4-UAS-Luc Addgene #33020 M. Walsh
Prizmatix USB Pulser TTL Generator for Optogenetics Goldstone Scientific
TM-CIBN-BLITz1-TetR-VP16 Addgene # 89878 H. Kwon
TrypLE Express Gibco 12604-013
Vehicle (Water-soluble carrier without CTZ) Prolume Inc. (NanoLight) 3031C control for in vivo applications with CTZ
VP-EL222 K. Gardner
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Crespo, E. L., Bjorefeldt, A., Prakash, M., Hochgeschwender, U. Bioluminescent Optogenetics 2.0: Harnessing Bioluminescence to Activate Photosensory Proteins In Vitro and In Vivo. J. Vis. Exp. (174), e62850, doi:10.3791/62850 (2021).
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