NO-Redox生物学研究のための骨髄由来マクロファージの単離と 体外 培養

マクロファージにおけるこのプロトコールの効率を実証する前に、亜硝酸塩、およびBH4レベルを、10%のLCMまたは組換えM−CSFおよびGM−CSFのみを含むFBSの10%を添加した培地で評価した。亜硝酸塩は、一酸化窒素代謝の最終生成物として長い間考えられてきたが、現在では一酸化窒素の生理学的貯蔵とみなされており、これは必要なときにリサイクルすることができ、したがって、一酸化窒素バイオアベイラビリティの指標としてしばしば使用されている7。BH4は、NO生産のためのNOSの必須補因子である。 図2に見られるように、10Sを補充した培地は、M-CSF/GM-CSFまたはLCMに関係なく、同様の亜硝酸塩レベルを有していた。しかしながら、異なるLCMバッチ間でより多くの変動性は観察されなかった。この観察はBH4測定にも適用された。実際、LCMの1つのバッチ(バッチ#3)は、他の2つ(バッチ#1および#2)よりもBH4のレベルが有意に高かった。さらに、LCMバッチは、10Sおよび組換えサイトカインを補充した培地よりも有意に多くのビオプテリンを含んでいた。バッチ間の総ビオプテリンの有意な変動も測定した。これらの結果は、LCMよりも変動の少ないM-CSF源を使用することの重要性を示しています。 さらに、10Sを補充した培地は、2%または5%のFBSを含有する培地と比較して有意に高いレベルの亜硝酸塩を含んでいた。10%と5%の差はBH4について非常に有意であった(p<0.05)。しかし、同様のレベルのビオプテリンが定量化された。対照的に、OptiMEM + 0.2%BSAは亜硝酸塩およびBH4を欠いていたため、非常にクリーンで適切な媒体であった。しかしながら、Baileyらによって記載されているように、OptiMEMはマクロファージを刺激する際に一晩で1回のみ使用されることを意味するが、飢餓による細胞死は観察されなかった。DMEM:FBSの2%を補充したF12は、この問題を克服するために選択され、健康な細胞を得るために十分な栄養素を含みながら、亜硝酸塩およびBH4汚染を最小限に抑えた。実際、いくつかの亜硝酸塩が検出されているにもかかわらず、LPS/IFN刺激WTマクロファージ(1 x 106細胞で30-80 μM;データは示さず)と比較して、レベルはごくわずか(〜0.2μM )である。 実験データ、新しいBH4欠損マウスモデルからのBMDMの単離と特性評価、R26-CreERT2Gchfl/flでこの改良されたプロトコルを検証するために、ここでは紹介します。BH4はGTPシクロヒドロラーゼI(Gch1)遺伝子により産生される。図3Aに示すように、Gch1の欠乏は、BH4の喪失および結果としてのNOおよびその後の亜硝酸塩の消失をもたらし、そしてMcNeillらによって以前に実証されたように酸化ストレスを引き起こすスーパーオキシドアニオンの増加をもたらす8。このプロトコルはすでに明確に定義されており、Gch fl/fl T2Cモデル6,8などの異なるCre系からの他のBH4欠損マクロファージを培養するために使用されていますが、R26-CreER T2 Gchfl/flモデルは、Cre-ER T2系の条件付き活性化を利用してタモキシフェン治療後のGch1遺伝子を除去するため、ユニークです(図3B、これにより、さまざまな時点でのノックアウトと、車両対タモキシフェン治療の形での内部制御の使用が可能になります。この例では、細胞を、1日目および3日目にビヒクル(95%エタノール)または0.1/1.0μM 4-OHタモキシフェンのいずれかで処理した(ビヒクルおよびタモキシフェンストックの両方を、既存の培養体積の1mLに0.7/7.0μL添加する前に培地で1:100希釈)。 図3Dに見られるように、GTPCHタンパク質は、R26-CreERT2Gch fl/fl細胞ではタモキシフェン処理後に消失するが、Gch fl/fl細胞では消失しない。重要なことに、R26-CreERT2Gch fl/flおよびGchfl/fl制御細胞の両方が、LPS/IFN刺激後もiNOSを産生することができる(図3B、C)。Gch1遺伝子発現におけるこれらの変化およびGTPCHタンパク質における結果として生じる変化は、細胞内BH4レベルを有意に乱し、亜硝酸塩の産生を減弱させた。図4に示すように、R26-CreERT2Gch fl/flマウスから単離および培養されたBMDMは、タモキシフェン存在下での対照GCH fl/fl細胞からのBMDMと比較して、培地中でのBH4産生の有意な減少および亜硝酸塩蓄積の減少を示した。同様に、LCM培地で培養した同じ細胞も、消失したGch1発現を示した。これらの細胞は、おそらくBH4による培地およびFBSの汚染のために、4OHタモキシフェンによるGch1発現のノックアウト後も、依然としてかなりの量のBH4および亜硝酸塩を産生した。これは、L細胞含有培地で細胞を培養する上での新しい方法の明らかな改善を表している。 このモデルのさらなる特性評価は、異なる濃度のタモキシフェンに続く8日目における非活性化(M0)Gch fl/ flおよびR26-CreER T2Gchfl/fl BMDMとの間の形態に有意な差を示さない。 図5に示すように、両方のモデルは、細長い四肢を有する丸い形状からなる同量の接着細胞を示し、典型的には、非刺激マクロファージ9に期待される特徴を示す。 まとめると、これらの結果は、BMDMの単離および培養のこの方法が、マウスマクロファージの培養に適した純粋な細胞集団を提供することを実証する。この方法は、いくつかの培地製剤中に存在する外因性化合物の干渉なしにマウスマクロファージの培養を可能にする。 図1:骨髄細胞単離(パート1)からBMDMsの選択、分化、および刺激(パート2)を示す模式図。 (A)滅菌条件下で、解剖された脚は、70%エタノールで洗浄された後、清潔な細菌学的シャーレに入れられる。(B)骨に沿って鉗子とメスを掻きむしり、筋肉を慎重に取り除きます。(C)その後、骨の四肢を切り取り、骨髄を露出させる。(D)骨髄を骨の内腔に針を挿入することにより、10mLのPBSで満たされた10mLシリンジを用いて骨から洗い流す。(E)すべての骨髄が外れるように、針を骨を通して上下に動かす。骨は、その段階で白く透明に見えるはずで、取り除かれた骨髄はシャーレに集められます。(エフ-ジー)すべての骨について繰り返し、分解した骨髄を1mLシリンジに集め、70μmのセルストレーナーを通して清潔な50mL遠沈管に通す。スピンダウンし、後で使用するために凍結培地に細胞を再懸濁します。パート2はBMDMの選択、分化、および刺激を示しています この図の拡大版を見るにはここをクリックしてください。 図2:DMEM中の亜硝酸塩およびBH4レベル:F12 + GM-CSF + M-CSFまたはDMEM:F12+ L細胞培地。 (A)異なる培地中の亜硝酸塩レベルは、グリースアッセイ法を用いて測定した。(b)BH4およびビオプテリンレベルを、BH4標準物質を用いたHPLC定量によって異なる培地で測定した。データはSD±平均(n=3)として表され、データは多重比較によって一元配置分散分析を用いて分析された。記号は、グループ間のp<0.05を表す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図3:R26CreERT2モデルの導入 (A)酸化還元生物学におけるNOS補因子としてのBH4の役割を示すスキーム。(B)このマウスモデルにおける隣接するloxP部位およびタモキシフェンによるCre-ERT2の条件付き活性化によるGch1における臨界エクソン(2および3)の切除を詳述した模式図。(c)BMDMsがタモキシフェンで処理された場合の重要なエクソンの切除を実証するPCR(n=3個の独立動物を表す)。WTマウスは1030 bp PCR産物を産生し、一方Creの存在下では1392 bp産物が産生され、重要なエクソンの切除を確認した。(d)iNOS、GCH、およびBチューブリンのイムノブロット(n=3個の独立動物を表す)。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図4:マクロファージにおけるBH4欠損症の特性評価。(A,B)qRT-PCRは、タモキシフェンで処理したR26-CreERT2Gchfl/flモデルにおけるGch1発現の消失を確認する。青 = 新しい MCSF 法、緑 = 古典的な LCM 法。(C、D)HPLCによる細胞内BH4の分析は、0.1μMおよび1.0μMがBH4レベルを有意に低下させるのに十分であることを明らかにする。(E, F)Griessアッセイを用いた培地中の亜硝酸塩の測定は、非刺激BMDMが検出可能なレベルの亜硝酸塩を産生しないのに対し、Gch fl/flおよびR26-CreERT2Gch fl/fl BMDMがLPS/IFNγの存在下で亜硝酸塩を産生することを示している。有意に、R26-CreERT2Gchfl/flのタモキシフェン処理は、刺激BMDMにおける亜硝酸塩レベルを有意に低下させる。データは、(n = 3)±SDの平均として表される。記号は、グループ間のp<0.05を表す。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 図5:BMDMの形態の比較 タモキシフェンの様々な処置を伴う8日目のBMDMの光学顕微鏡観察によって得られた写真。スケールは画像に示されています。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。 文化料理 メディアボリューム シード密度 12ウェルディッシュ 1キロリットル 500,000 セル 6ウェルディッシュ 2キロリットル 1,000,000 セル 100 mmディッシュ 10ミリリットル 3,000,000 セル 75 cm2 フラスコ 15キロリットル 5,000,000 セル 表1:代表的な播種密度。