ביטוי GFP המושרה באור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 האופטוגנטית
Summary
אופטוגנטיקה היא כלי רב עוצמה עם יישומים רחבי היקף. פרוטוקול זה מדגים כיצד להשיג ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה באמצעות מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול.
Abstract
מערכות ביטוי גנים לא יסולא בפז הן כלי רב ערך לחקר תהליכים ביולוגיים. מערכות ביטוי אופטוגנטיות יכולות לספק שליטה מדויקת על תזמון ביטוי הגנים, המיקום והמשרעת באמצעות אור כסוכן המעורר. בפרוטוקול זה, מערכת ביטוי אופטוגנטית משמשת להשגת ביטוי גנים שאינו ניתן לניתוק לאור בעוברי דגי זברה. מערכת זו מסתמכת על גורם שעתוק מהונדס הנקרא TAEL המבוסס על גורם שעתוק המופעל על ידי אור ממקור טבעי מהחיידק E. litoralis. כאשר הוא מואר באור כחול, TAEL דימרייז, נקשר לאלמנט הרגולטורי הקוגניטיבי שלו הנקרא C120, ומפעיל תמלול. פרוטוקול זה משתמש בעוברי דגי זברה מהונדסים המבטאים את גורם התמלול של TAEL תחת שליטתו של מקדם ה- ubb בכל מקום. יחד עם זאת, האלמנט הרגולטורי C120 מניע את הביטוי של גן עיתונאי פלואורסצנטי (GFP). באמצעות לוח LED פשוט כדי לספק הפעלת אור כחול, אינדוקציה של ביטוי GFP ניתן לזהות תחילה לאחר 30 דקות של תאורה ומגיע לשיא של אינדוקציה יותר מפי 130 לאחר 3 שעות של טיפול באור. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מוערכת על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR) ועל ידי מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. שיטה זו היא גישה רב-תכליתית וקלה לשימוש לביטוי גנים אופטוגנטיים.
Introduction
מערכות ביטוי גנים לא ניתנות לתקדים מסייעות לשלוט בכמות, בתזמון ובמיקום של ביטוי גנים. עם זאת, השגת שליטה מרחבית וטמפורלית מדויקת באורגניזמים רב-תאיים הייתה מאתגרת. בקרת זמן מושגת בדרך כלל על ידי הוספתתרכובות מולקולה קטנה 1 או הפעלה של מקדמי הלם חום2. עם זאת, שתי הגישות חשופות לסוגיות של תזמון, כוח אינדוקציה ותגובות לחץ מחוץ למטרה. שליטה מרחבית מושגת בעיקר על ידי שימוש ביזמים ספציפיים לרקמות3, אבל גישה זו דורשת מקדם מתאים או אלמנט רגולטורי, אשר לא תמיד זמינים, וזה לא תורם אינדוקציה ברמת תת רקמות.
בניגוד לגישות קונבנציונליות כאלה, מפעילי שעתוק אופטוגנטיים המופעלים על ידי אור יש פוטנציאל לשליטה מרחבית וטמפורלית עדינה יותר של ביטויגנים 4. מערכת TAEL/C120 בעלת אור כחול פותחה ומותבת לשימוש בעוברי דגי זברה5,6. מערכת זו מבוססת על גורם שעתוק אנדוגני המופעל על ידי אור מהחיידק E. litoralis7,8. מערכת TAEL/C120 מורכבת מפעיל תמלול בשם TAEL המכיל תחום הפעלה Kal-TA4, תחום LOV מגיב אור כחול (חישת מתח אור)ותחוםכריכת DNA של הסליל-תור-סליל (HTH). כאשר מוארים, תחומי LOV עוברים שינוי קונפורמציה המאפשר לשתי מולקולות TAEL לעמעם, להיקשר למקדם C120 מגיב TAEL, וליזום תמלול של גן במורד הזרם של עניין5,8. מערכת TAEL/C120 מציגה אינדוקציה מהירה וחזקה עם רעילות מינימלית, והיא יכולה להיות מופעלת על ידי מספר שיטות אספקת אור שונות. לאחרונה, שיפורים במערכת TAEL / C120 נעשו על ידי הוספת אות לוקליזציה גרעינית ל- TAEL (TAEL-N) ועל ידי צימוד האלמנט הרגולטורי C120 למקדם בסיס cFos (C120F) (איור 1A). שינויים אלה שיפרו את רמות האינדוקציה ביותר מפי 15.
בפרוטוקול זה, לוח LED פשוט משמש להפעלת מערכת TAEL / C120 ולזירוז הביטוי בכל מקום של גן כתב, GFP. אינדוקציה של ביטוי יכולה להיות מנוטרת באופן איכותי על ידי התבוננות בעוצמת הפלואורסצנטיות או כמותית על ידי מדידת רמות התמליל באמצעות PCR כמותי בזמן אמת (qRT-PCR). פרוטוקול זה יציג את מערכת TAEL/ C120 ככלי רב-תכליתי וקל לשימוש המאפשר רגולציה חזקה של ביטוי גנים ב- vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את השימוש במערכת TAEL/C120 האופטוגנטית להשגת ביטוי גנים כחול שאינו ניתן לתפוקה באור. מערכת זו מורכבת מפעיל תמלול, TAEL, כי dimerizes על תאורה עם אור כחול ומפעיל שעתוק של גן עניין במורד הזרם של אלמנט רגולטורי C120. ביטוי מושרה של כתב GFP ניתן לזהות לאחר מעט כמו 30 דקות של חשיפה לאור, דבר המצב…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לסטפן מטרנה ולחברים במעבדות וו ומטורנה על הצעות והערות מועילות על פרוטוקול זה. אנו מודים לאנה ריד, קווין גרדנר ולורה מוטה-מינה על דיון ותובנות יקרי ערך בעת פיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מהמכונים הלאומיים לבריאות (NIH; R03 DK106358) והוועדה לתיאום חקר הסרטן של אוניברסיטת קליפורניה (CRN-20-636896) ל- S.W.
Materials
| BioRender web-based science illustration tool | BioRender | https://biorender.com/ | |
| Color CCD digital camera | Lumenara | 755-107 | |
| Compact Power and Energy Meter Console, Digital 4" LCD | Thorlabs | PM100D | |
| Excitation filter, 545 nm | Olympus | ET545/25x | |
| illustra RNAspin Mini kit | GE Healthcare | 95017-491 | |
| Instsant Ocean Sea Salt | Instant Ocean | SS15-10 | |
| MARS AQUA Dimmable 165 W LED Aquarium light (blue and white) | Amazon | B017GWDF7E | |
| Methylcellulose | Sigma-Aldrich | M7140 | |
| NEARPOW Programmable digital timer switch | Amazon | B01G6O28NA | |
| PerfeCTa SYBR green fast mix | Quantabio | 101414-286 | |
| Photoshop image procesing software | Adobe | ||
| Prism graphing and statistics software | GraphPad | ||
| qScript XLT cDNA SuperMix | Quantabio | 10142-786 | |
| QuantStudio 3 Real-Time PCR System | Applied Biosystems | A28137 | |
| Stereomicroscope | Olympus | SZX16 | |
| Tricaine (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| X-Cite 120 Fluorescence LED light source | Excelitas | 010-00326R | Discontinued. It has been replaced with the X-Cite mini+ |
References
- Knopf, F., et al. Dually inducible TetON systems for tissue-specific conditional gene expression in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (46), 19933-19938 (2010).
- Halloran, M. C., et al. Laser-induced gene expression in specific cells of transgenic zebrafish. Development. 127 (9), 1953-1960 (2000).
- Hesselson, D., Anderson, R. M., Beinat, M., Stainier, D. Y. R. Distinct populations of quiescent and proliferative pancreatic beta-cells identified by HOTcre mediated labeling. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (35), 14896-14901 (2009).
- Tischer, D., Weiner, O. D. Illuminating cell signalling with optogenetic tools. Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (8), 551-558 (2014).
- Reade, A., et al. TAEL: a zebrafish-optimized optogenetic gene expression system with fine spatial and temporal control. Development. 144 (2), 345-355 (2017).
- LaBelle, J., et al. TAEL 2.0: An improved optogenetic expression system for zebrafish. Zebrafish. 18 (1), 20-28 (2021).
- Rivera-Cancel, G., Motta-Mena, L. B., Gardner, K. H. Identification of natural and artificial DNA substrates for light-activated LOV-HTH transcription factor EL222. 생화학. 51 (50), 10024-10034 (2012).
- Motta-Mena, L. B., et al. An optogenetic gene expression system with rapid activation and deactivation kinetics. Nature Chemical Biology. 10 (3), 196-202 (2014).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of visualized experiments: JoVE. (69), e4196 (2012).
- Holder, N., Xu, Q. Microinjection of DNA, RNA, and Protein into the Fertilized Zebrafish Egg for Analysis of Gene Function. Molecular Embryology. , 487-490 (1999).
- Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- Wang, X., Chen, X., Yang, Y. Spatiotemporal control of gene expression by a light-switchable transgene system. Nature Methods. 9 (3), 266-269 (2012).
- Mruk, K., Ciepla, P., Piza, P. A., Alnaqib, M. A., Chen, J. K. Targeted cell ablation in zebrafish using optogenetic transcriptional control. Development. 147 (12), (2020).
- Liu, H., Gomez, G., Lin, S., Lin, S., Lin, C. Optogenetic control of transcription in zebrafish. PloS One. 7 (11), 50738 (2012).
- Shimizu-Sato, S., Huq, E., Tepperman, J. M., Quail, P. H. A light-switchable gene promoter system. Nature Biotechnology. 20 (10), 1041-1044 (2002).
- Krueger, D., et al. Principles and applications of optogenetics in developmental biology. Development. 146 (20), (2019).
