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생화학

組換えCa2+-ATPaseNドメインにおけるトリプトファン残基の化学修飾

Published: October 09, 2021
doi:
10.3791/62770
,
1Instituto de Física,Universidad Autónoma de San Luis Potosí

Summary

ANSはCa2+-ATPase組換えNドメインに結合する。蛍光スペクトルは、295nmの波長で励起時にFRET様パターンを表示します。TrpのNBS媒介化学修飾は、Nドメインの蛍光を発し、Trp残基とANSとの間のエネルギー移動(FRET)の欠如をもたらす。

Abstract

サルコ/小胞体Ca2+-ATPase(SERCA)は、様々な立体構造で結晶化されたP型ATPaseです。それにもかかわらず、詳細な機能情報は、分離組換えドメインから得ることができる。この組み換えヌクレオチド結合ドメイン(N-ドメイン)は、リガンド結合時に蛍光消光を表示する(Trp552LeuおよびTyr587Trp)。外因性フルオロフォア、すなわち8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)は、アルグ、ヒス、アラ、ルー、およびPhe残基との静電および疎水性相互作用を介してヌクレオチド結合部位に結合する。ANS結合は、370nmの波長(λ)で励起された場合の蛍光強度の増加によって証明される。しかし、295nmのλで励起すると、蛍光強度の増加は、Nドメイン固有蛍光の急行に結合されるようである。蛍光スペクトルは、フェスター共鳴エネルギー伝達(FRET)様のパターンを示し、Trp-ANS FRETペアの存在を示唆し、Tyr587TrpとANSの間の短距離(〜20Å)によって支持されているように見える。本研究では、N-ブロモスハクイミド(NBS)によって媒介されるTrp化学修飾(および蛍光焼入れ)によるTrp-ANS FRET対の分析について説明する。化学修飾N-ドメインでは、ANS蛍光は295nmのλで励起されると増加し、λ370nmで励起された場合と同様である。したがって、Trp残基のNBS媒介化学修飾は、TrpとANSの間のFRETの不在をプローブするために使用することができる。Trp蛍光がない場合、ANS蛍光の増加を観察すべきではありません。NBSによるタンパク質中のTrp残基の化学修飾は、結合ANSに近いTrp残基間のFRETを調べるのに有用であり得る。このアッセイは、他の蛍光ホルを使用する場合にも有用である可能性が高い。

Introduction

フェスター共鳴エネルギー移動(FRET)は、タンパク質構造および機能研究1、2、3、4における結合または相互作用後の分子構造間の距離を決定するための標準的な技術となっている。P型ATPAでは、FRETはサルコ・エンデュラム・Ca2+-ATPase(SERCA)2、5、6、7、8、例えば、FRET7によってタンパク質全体の構造と機能を調べるのに用いられている。

FRETドナーは多様であり、小さな蛍光(外因性)分子から蛍光タンパク質9,10まで多岐にわたります。トリプトファン(Trp)残基(蛍光による)は、タンパク質アミノ酸配列11,12の構造変化を同定するのに有用である。Trpの蛍光強度は、周囲の環境13,14の極性に大きく依存する。リガンド結合は通常、タンパク質/酵素15,16において構造的な再配置を生じさせる。Trpがタンパク質結合部位に存在するか、または近くに位置する場合、構造変動は水性媒体13、14へのTrp曝露の程度にしばしば影響を及ぼす。したがって、極性の変化は、Trp蛍光強度13、14の焼入れをもたらす。したがって、Trpの蛍光特性は、酵素のリガンド結合研究を行う上で有用である。他の物理現象は、Trp蛍光17、18、19、20、例えば、FRETおよび中極性の変化を導く可能性がある。Trpの励起状態からフルオロフォアへのエネルギー伝達も潜在的な用途を有し、例えば、タンパク質21における小さなリガンドの親和性決定も可能である。実際、Trpは主にタンパク質22、23、24、例えばテルビウム(Tb3+)FRET研究においてFRET研究において蛍光ドナーとして使用されてきたが、Trp残基はTb3+25、26、27へのエネルギー伝達のためのアンテナとして頻繁に使用されている。Trpは、タンパク質構造におけるその固有の構成的特徴に起因する他のFRETドナーに対して様々な利点を示し、研究したタンパク質24の機能/構造に影響を与える可能性のある予備プロセスの必要性を排除する。したがって、放射崩壊の同定(エネルギー移動およびタンパク質構造再構成によって誘導される中極性の変化)は、タンパク質構造研究13、14、19、28におけるリガンド結合に関する正確な結論を導き出す上で重要である。

タンパク質構造研究において、外因性フルオロフォア、すなわち8-アニリノ-1-ナフタレンスルホン酸(ANS)は、タンパク質のフォールディング/展開28,29に関連する実験に主に使用されてきた。ANSは、天然の状態でタンパク質/酵素に結合します, 通常、基質の結合部位で 31,32,33;ANS蛍光量子収量(ΦF)の増加(すなわち、蛍光強度の増加)は、疎水性ポケット内のArgおよびHis残基とのANSの適切な相互作用が34、35、36、37に生じたときにλ=370nmでタンパク質を励起することによって誘導される。様々な研究では、Trp残基(ドナー)とANS(アクセプター)の間のFRET(280-295 nm以内のλでエキサイティングな場合)の発生が報告されており、これは以下に基づいている:1)Trpの蛍光発光スペクトルとANSの励起スペクトルの重複、2)1つ以上のTrp残基(s)とANSの間の適切な距離の同定 3)タンパク質ポケットに結合したときの高いANS量子収率、および4)ANS3、17、27、37、38の存在下でタンパク質の蛍光スペクトルにおける特徴的なFRETパターン。

最近、SERCAおよび他のP型ATPasesにおけるヌクレオチド結合ドメイン(Nドメイン)へのリガンド結合は、40、41、42、43、44、45、46の組換え組換えNドメインを用いて検討されている。SERCA Nドメインの分子工学は、唯一のTrp残基(Trp552Leu)をヌクレオチド結合部位に近いより動的な構造(Tyr587Trp)に移動するために使用され、そこでは、リガンド結合時の構造変化(クエンチング)を使用して、リガンド結合時の構造変化を監視することができる。実験結果は、ANSが精製組換えSERCA N-domain34中のヌクレオチド結合部位に(ATPとして)結合することを実証した。興味深いことに、ANS蛍光は295nmのλで励起時にNドメインに結合すると増加し、Nドメインの固有蛍光は34を減少させ、それによってTrp-ANS FRETペアの形成を示唆するFRETパターンを産生する。

NBSの使用は、改変タンパク質の吸光度アッセイによりタンパク質47中のTrp残基の含有量を決定するために提案されている。NBSは、Trpの吸収性の高いインドール基を、吸収性の低いオキシインドール47、48に変更する。これは、Trp蛍光性40の損失(クエンチング)をもたらす。したがって、Trp残基のNBS媒介化学修飾は、FRETが仮説を立てられたときのTrp(ドナーとしての)役割を定義するアッセイとして使用され得る。

このプロトコルは、タンパク質モデルとしてSERCAの組換えN-ドメインを設計したN-ドメインにおけるNBSによる唯一のTrp残基の化学修飾を記述する。実験結果は、ANS蛍光強度が、本質的な蛍光を欠いている化学的にNBS修飾Nドメイン34において依然として増加することを示す。したがって、このアッセイは、N-ドメイン34、40、49に結合した場合にTrp残基とANSの間にFRETの欠如を実証するのに有用である。したがって、このアッセイ(TRPのNBS化学修飾)は、タンパク質中のTrp-ANS FRETペアの存在を証明するのに有用である。

Protocol

1. ANSとSERCA Nドメイン相互作用の決定(インシリコで) 好ましいタンパク質モデリングソフトウェア50を用いて分子モデリングによりタンパク質の3次元(3D)構造を生成する。 好ましい分子構造ソフトウェア51を用いてヌクレオチド結合部位を形成するアミノ酸残基を特定し、ArgおよびLys残基35の存在を決定する。これらは?…

Representative Results

分子ドッキングは、静電および疎水性相互作用を介したNドメインのヌクレオチド結合部位へのANSの結合を示す(図1)。Trp残基とANS(ヌクレオチド結合部位に結合)との間の分子距離(20Å)は、FRETの発生をサポートする(図1)。この設計された(設計された)組換えN-ドメインは、アフィニティークロマトグラフィー(図2)により高純度で?…

Discussion

ANS-Nドメイン複合体の蛍光スペクトルは、295nmのλで励起された場合にFRET様パターンを表示し、一方、Trp残基とANSとの間の分子距離(20Å)はFRETの発生を支持しているようだ(図1)。NBSによるTrp化学修飾は、蛍光Nドメインの低下をもたらす(図3B、スペクトラムf)。したがって、エネルギー転送は不可能です。ANS蛍光スペクトルは、295nmのλで励起された非?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、FAI-UASLP助成金番号C19-FAI-05-89.89およびCONACYT助成金番号316463(アポヨス・ア・ラ・シエンシア・デ・フロンテーラ:フォルタレシミエント・イ・マンテニミエント・デ・インシュタエンストラス・デ・インベスティガシオン・デ・ウソ・コンン・イ・カパシタシオン・テクニツァン)によって部分的に資金提供されました。著者らは、ビデオ版でジュリアン・E・マタ・モラレスの技術的支援に感謝しています。

Materials

Acrylamide Bio-Rad 1610107 SDS-PAGE
Ammonium persulfate Bio-Rad 1610700 SDS-PAGE
8-Anilino-1-naphthalenesulfonic acid Sigma-Aldrich A1028 Fluorophore
Bis-acrylamide Bio-Rad 1610125 SDS-PAGE
N-Bromosuccinimide Sigma-Aldrich B81255 Chemical modification
N,N-dimethylformamide J.T. Baker 9213-12 Stock solution preparation
Fluorescein isothiocyanate Sigma-Aldrich F7250 Chemical fluorescence label
Fluorescence cuvette Hellma Z801291 Fluorescence assay
Fluorescence Spectrofluorometer Shimadzu RF 5301PC Fluorescence assay
HisTrap™ FF GE Healtcare 11-0004-59 Protein purification
IPTG, Dioxane free American Bionalytical AB00841-00010 Protein expression
Imidazole Sigma-Aldrich I5513-25G Protein purification
LB media Fisher Scientific 10000713 Cell culture
Pipetman L P10L Gilson FA10002M Fluorescence assay
Pipetman L P100L Gilson FA10004M Fluorescence assay
Pipetman L P200L Gilson FA10005M Fluorescence assay
Pipetman L P1000L Gilson FA10006M Fluorescence assay
Pipetman L P5000L Gilson FA10007 Fluorescence assay
Precision plus std Bio-Rad 1610374 SDS-PAGE
Sodium dodecyl sulphate Bio-Rad 1610302 SDS-PAGE
Sodium phosphate dibasic J.T. Baker 3828-19 Buffer preparation
Sodium phosphate monobasic J.T. Baker 3818-01 Buffer preparation
Syringe filter 0.2 um Millipore GVWP04700 Solution filtration
Temed Bio-Rad 1610801 SDS-PAGE
Tris Bio-Rad 1610719 SDS-PAGE
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Sampedro, J. G., Cataño, Y. Chemical Modification of the Tryptophan Residue in a Recombinant Ca2+-ATPase N-domain for Studying Tryptophan-ANS FRET. J. Vis. Exp. (176), e62770, doi:10.3791/62770 (2021).
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