重组卡^{2 +}- 研究色氨酸 - ANS FRET 的色氨酸残留物的化学修饰 - ATPase N 域

Füster共振能量转移（FRET）已成为确定分子结构之间的距离后，结合或相互作用的蛋白质结构和功能研究^{1，2，3，4}的标准技术。在P型ATPases中，FRET被用来研究SARCO内质视网膜Ca 2+-ATPase（SERCA）2、5、6、7、8的结构波动，例如，FRET⁷对整个蛋白质的结构波动进行了分析。

FRET捐赠者是多种多样的，从小荧光（外在）分子到荧光蛋白^9，10。色氨酸（Trp）残留物（由于其荧光）有助于识别蛋白质氨基酸序列^11，12的结构变化。Trp的荧光强度在很大程度上取决于其周围环境^的极^性。利甘结合通常产生蛋白质/酶^15，16的结构重新排列。如果Trp位于或位于蛋白质结合部位附近，结构波动通常会影响Trp暴露在^13、14等水平：因此，极性的变化导致Trp荧光强度^13，14的淬火。因此，Trp 的荧光特性对于对酶进行配体结合研究很有用。其他物理现象也可能导致Trp荧光淬火17，18，19，20，例如，FRET和中等极性的变化。能量从兴奋状态的Trp转移到氟也具有潜在的应用，例如，在蛋白质²¹中小配体的亲和力测定。事实上，Trp在FRET研究中主要用作^22、23、24等蛋白质的荧光捐献者，例如，在terbium（Tb^3+）FRET研究中，Trp残留物经常被用作能量转移到Tb 3+25、26、27的天线。Trp由于其在蛋白质结构中固有的构成特性，与其他FRET捐赠者相比具有各种优势，从而消除了可能影响所研究蛋白质²⁴的功能/结构的预制过程的需要。因此，在蛋白质结构研究^{13、14、19、28}中，对辐射衰变（由蛋白质结构重组引起的能量转移和中等极性变化）的识别对于得出关于配体结合的准确结论非常重要。

在蛋白质结构研究中，一种外在的氟磷，即8-阿尼利诺-1-纳布他烯硫酸盐（ANS），主要用于与蛋白质折叠/展开^{有关的实验。}ANS与原生状态的蛋白质/酶结合，通常在^{基板31、32、33}的结合部位：ANS荧光量子产量（+F）的增加（即荧光强度的增加）是由刺激蛋白质在\370纳米时，ANS与Arg的适当相互作用和他的残留物在疏水口袋发生^{34，35，36，37。}在各种研究中， 已报告TRP残留物（捐赠者）和ANS（接受者）之间的FRAT（当在280-295纳米内激动人心时）的发生，其依据如下：1） Trp 的荧光发射光谱和 ANS 的激发光谱重叠，2） 确定一个或多个 Trp 残留物与 ANS 之间的适当距离用于能量转移， 3） 高ANS量子产量时，结合在蛋白质口袋，和4）特征FRET模式在蛋白质的荧光光谱中存在ANS 3，17，27，37，38。

最近，使用工程重组N域^{40、41、42、43、44、45、46}等对SERCA和其他P型ATPass的核苷酸结合域（N域）进行了配体结合。SERCA N域的分子工程已用于将唯一的Trp残留物（Trp552Leu）移动到一个更动态的结构（Tyr587Trp），该结构靠近核苷酸结合部位，其中荧光变异（淬火）可用于监测配体结合³⁴时的结构变化。实验结果表明，ANS与纯重组剂SERCA N-domain³⁴中的核苷酸结合部位（作为ATP）结合。有趣的是，ANS 荧光在激发时以 295 nm 的激发度与 N 域结合时增加，而 N 域的内在荧光减少^34，从而产生一个 FRET 模式，表明 Trp-ANS FRET 对的形成。

已建议使用 NBS 通过对改性蛋白质的吸收分析来确定^{蛋白质 47}中的 Trp 残留物含量。NBS将Trp高度吸收的内陆组修改为吸收性较小的奥辛多莱^47，48。这导致Trp荧光财产损失（淬火^）40。因此，NBS 调解的Trp残留物的化学修饰可以用作在FRET假设时定义Trp（作为供体）的作用的测定。

本协议将国家统计局在 SERCA 工程重组 N 域中唯一 Trp 残留物的化学修改描述为蛋白质模型。实验结果表明，在化学NBS改性N-domain³⁴中，ANS荧光强度仍在增加，缺乏内在荧光。因此，当与 N 域^34、40、49绑定时^，该检测有助于证明 Trp 残留物和 ANS 之间没有 FRET。因此，这种检测（Trp的NBS化学修饰）有助于证明Trp-ANS FRET对在蛋白质中的存在。