間葉系幹細胞のマクロファージ食前細胞の調節;定量とイメージング
Summary
ここで提示されるプロトコルは、pH感受性蛍光分子に結合された非オプゾン化酵母(zymosan)粒子のマクロファージ(MΦ)食作用の間葉幹細胞(MSC)媒介性調節の動的画像を定量化し、生成するプロトコルです。
Abstract
間葉系幹細胞(MSC)は、伝統的に再生特性について研究されてきましたが、最近では免疫調節特性が最前線に位置しています。彼らは免疫細胞の活性と相互作用し、調節します。.本研究の焦点は、マクロファージ貪食活動のMSC調節である。マクロファージ(MΦ)貪食症は、感染に対する自然免疫系の反応の重要な部分であり、MSCがこの応答を調節するメカニズムは積極的に調査中である。本明細書に提示される非オプソ化ザイモサン粒子のMΦ食細胞化を研究する方法であり、MSCと共培養中にpH感受性蛍光分子に結合する。食作用活性が増加し、標識されたザイモサン粒子がファゴリソームの酸性環境内に封入されると、pH感受性分子の蛍光強度が高くなる。適切な励起波長と発光波長により、蛍光分光光度計を用いて貪食活性を測定し、70分の間に相対的な蛍光単位の変化として運動データを提示します。この定量的データをサポートするために、食作用活性の変化を動的イメージングを用いて可視化する。この方法を用いた結果は、共培養時に、MSCがナイーブとIFN γの両方の非オプソナイズザイモサンのMΦ貪食症を増強することを示γ MΦを治療した。これらのデータは、自然免疫系のMSC調節の現在の知識に追加されます。この方法は、将来の調査で、基礎となる細胞および分子機構を完全に引き出すために適用することができます。
Introduction
間葉系幹細胞(MSC)は、結合組織細胞を生み出す前駆細胞です。MSCは、哺乳動物の成人組織に存在し、骨髄1から単離することができる。それらの免疫調節特性のために、これらの細胞は広く研究されている2.初期の研究は、T細胞3、4、5、6のMSC調節に焦点を当てたが、最近では、自然免疫の主要な細胞成分であるマクロファージ細胞(MΦ)の調節が、7、8、9、10、11、12、13、14の注目を集めている.炎症性疾患の治療におけるMSC-MΦ相互作用の重要性は、単球/マクロファージの枯渇が動物モデル8におけるMSCの治療効果を損なうという事実によって強調される。ここで、焦点はMΦとMSCの細胞接触相互作用である。MSCは、炎症反応から抗炎症反応への切り替えを促進することによってMΦの表現型を調節する能力を有し、組織修復活動8、9、10、11に至り、これらの調節メカニズムを実証するために多くが行われている。他の状況下では、MSCはMΦ駆動の炎症反応12、13を支持または悪化させ、MΦ貪食活性14、15を増強することができる。しかし、MSCがMΦ貪食活性を調節するメカニズムと条件を特定する既存のデータが欠けています。
MΦは、オプゾン化(抗体または補体被覆)または食作用に至る非オプソン化病原体のいずれかを認識する受容体のファミリーを有する16。後者の活性化と活動はあまりよく研究されていない17.非炎症性インビトロ環境において、MSCは非オプソン化病原体13のMΦ貪食症を増強する。しかし、MΦによる非オプソナイズ病原体の認識は、適応免疫応答中にリンパ球によって産生される炎症環境への曝露後に減少し得る。天然キラー細胞およびエフェクターリンパ球によって放出されるIFN-γは、非オプソン化粒子18のMΦ貪食症に対して阻害効果を有する。MΦ貪食症のMSC直接接触調節機構を研究するために、共培養モデルが開発された。ここで提示する実験の目的は、MΦがIFN-γにさらされた後にMSCが非オプス化病原体のMΦ貪食症を調節するかどうかを決定することです(図1)。
Protocol
Representative Results
Discussion
pH感受性色素に結合した生体粒子を用いた貪食の分析は、従来の蛍光標識粒子12、19、20よりも有利であることが証明された比較的新しいツールである。従来の蛍光標識粒子では、エンドポイント分析のみが可能です。検出は、食細胞によって取り込まれていない粒子を洗浄または消毒した後、蛍光顕微鏡および/または分光…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、NSFの主要な研究機器メカニズムによって、1626093および1919583の助成金の下で支えられた。
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
- Phinney, D. G., Prockop, D. J. Concise review: Mesenchymal stem/multipotent stromal cells: The state of transdifferentiation and modes of tissue repair–current views. Stem Cells. 25 (11), 2896-2902 (2007).
- Bernardo, M. E., Fibbe, W. E. Mesenchymal stromal cells: sensors and switchers of inflammation. Cell Stem Cell. 13 (4), 392-402 (2013).
- Tobin, L. M., Healy, M. E., English, K., Mahon, B. P. Human mesenchymal stem cells suppress donor CD4(+) T cell proliferation and reduce pathology in a humanized mouse model of acute graft-versus-host disease. Clinical and Experimental Immunology. 172 (2), 333-348 (2013).
- Giuliani, M., et al. Long-lasting inhibitory effects of fetal liver mesenchymal stem cells on T-lymphocyte proliferation. PLoS One. 6 (5), 19988 (2011).
- Plumas, J., Chaperot, L., Richard, M. J., Molens, J. P., Bensa, J. C., Favrot, M. C. Mesenchymal stem cells induce apoptosis of activated T cells. Leukemia. 19 (9), 1597-1604 (2005).
- Luz-Crawford, P., et al. Mesenchymal stem cells generate a CD4+CD25+Foxp3+ regulatory T cell population during the differentiation process of Th1 and Th17 cells. Stem Cell Research & Therapy. 4 (3), 65 (2013).
- Waterman, R. S., Tomchuck, S. L., Henkle, S. L., Betancourt, A. M. A new mesenchymal stem cell (MSC) paradigm: Polarization into a pro-inflammatory MSC1 or an Immunosuppressive MSC2 phenotype. PLoS One. 5 (4), 10088 (2010).
- Nemeth, K., et al. marrow stromal cells attenuate sepsis via prostaglandin E(2)-dependent reprogramming of host macrophages to increase their Interleukin-10 production. Nature Medicine. 15 (1), 42-49 (2009).
- Maggini, J., et al. Mouse Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells Turn Activated Macrophages into a Regulatory-Like Profile. PLoS One. 5 (2), 9252 (2010).
- Takizawa, N., et al. marrow-derived mesenchymal stem cells propagate immunosuppressive/anti-inflammatory macrophages in cell-to-cell contact-independent and-dependent manners under hypoxic culture. Experimental Cell Research. 358 (2), 411-420 (2017).
- Kim, J., Hematti, P. Mesenchymal stem cell-educated macrophages: a novel type of alternatively activated macrophages. Experimental Hematology. 37 (12), 1445-1453 (2009).
- Evans, J. F., Salvador, V., George, S., Trevino-Gutierrez, C., Nunez, C. Mouse aorta-derived mesenchymal progenitor cells contribute to and enhance the immune response of macrophage cells under inflammatory conditions. Stem Cell Research & Therapy. 6 (1), 56 (2015).
- Cho, D. I., et al. Mesenchymal stem cells reciprocally regulate the M1/M2 balance in mouse bone marrow-derived macrophages. Experimental Molecular Medicine. 46, 70 (2014).
- Fernandez, N., et al. Mouse mesenchymal progenitor cells expressing adipogenic and osteogenic transcription factors suppress the macrophage inflammatory response. Stem Cells International. 2017, 5846257 (2017).
- Jackson, M. V., et al. Mitochondrial transfer via tunneling nanotubes is an important mechanism by which mesenchymal stem cells enhance macrophage phagocytosis in the in vitro and in vivo models of ARDS. Stem Cells. 34 (8), 2210-2223 (2016).
- Chaplin, D. D. Overview of the immune response. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 125 (2), 3-23 (2010).
- Lim, J., et al. Characterizing the mechanisms of nonopsonic uptake of cryptococci by macrophages. Journal of Immunology. 200 (10), 3539-3546 (2018).
- Wang, Z., et al. Interferon-γ inhibits nonopsonized phagocytosis of macrophages via an mTORC1-c/EBP pathway. Journal of Innate Immunity. 7 (2), 165-176 (2015).
- Lindner, B., Burkard, T., Schuler, M. Phagocytosis assays with different PH-sensitive fluorescent particles and various readouts. Biotechniques. 68, 245-250 (2020).
- Kapellos, T. S., et al. A novel real time imaging platform to quantify macrophage pahgocytosis. Biochemical Pharmacology. 116, 107-119 (2016).
- Takahashi, D., et al. Flow cytometric quantitation of platelet phagocytosis by monocytes using a pH-sensitive dye, pHrodo-SE. Journal of Immunological Methods. 447, 57-64 (2017).
