Mesenchymale Stammzellregulation der Makrophagen-Phagozytose; Quantifizierung und Bildgebung
Summary
Hier wird ein Protokoll zur Quantifizierung und Erzeugung dynamischer Bilder der mesenchymalen Stammzell (MSC) vermittelten Regulation der Makrophagen (MΦ) Phagozytose von nicht opsonisierten Hefepartikeln (Zymosan) vorgestellt, die zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind.
Abstract
Mesenchymale Stammzellen (MSC) wurden traditionell auf ihre regenerativen Eigenschaften untersucht, aber in jüngster Zeit standen ihre immunregulatorischen Eigenschaften im Vordergrund. Sie interagieren mit und regulieren die Aktivität von Immunzellen. Der Schwerpunkt dieser Studie liegt auf der MSC-Regulation der phagozytären Aktivität von Makrophagen. Makrophagen (MΦ) Phagozytose ist ein wichtiger Teil der angeborenen Reaktion des Immunsystems auf infektionen, und die Mechanismen, durch die MSC diese Reaktion modulieren, werden aktiv untersucht. Hier wird eine Methode zur Untersuchung der MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Zymosanpartikeln vorgestellt, die in Kokultur mit MSC zu einem pH-empfindlichen fluoreszierenden Molekül konjugiert sind. Wenn die phagozytische Aktivität zunimmt und die markierten Zymosanpartikel in der sauren Umgebung des Phagolysosoms eingeschlossen sind, erhöht sich die Fluoreszenzintensität des pH-empfindlichen Moleküls. Mit den entsprechenden Anregungs- und Emissionswellenlängen wird die phagozytische Aktivität mit einem Fluoreszenzspektrophotometer gemessen und kinetische Daten werden als Änderungen der relativen Fluoreszenzeinheiten über einen Zeitraum von 70 Minuten dargestellt. Um diese quantitativen Daten zu unterstützen, wird die Veränderung der phagozytischen Aktivität mittels dynamischer Bildgebung visualisiert. Die Ergebnisse dieser Methode zeigen, dass MSC in Kokultur die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisiertem Zymosan sowohl von naivem als auch von IFN-γ MΦ verbessert. Diese Daten ergänzen das aktuelle Wissen über die MSC-Regulation des angeborenen Immunsystems. Diese Methode kann in zukünftigen Untersuchungen angewendet werden, um die zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen vollständig abzugrenzen.
Introduction
Mesenchymale Stammzellen (MSC) sind Vorläuferzellen, aus denen Bindegewebszellen entstehen. MSC sind in adulten Säugetiergeweben vorhanden und können aus dem Knochenmark isoliert werden1. Aufgrund ihrer immunmodulatorischen Eigenschaften werden diese Zellen umfassend untersucht2. Frühe Studien konzentrierten sich auf die MSC-Regulation von T-Zellen3,4,5,6, aber in jüngerer Zeit hat ihre Regulation von Makrophagenzellen (MΦ), einer wichtigen zellulären Komponente der angeborenen Immunität, erhöhte Aufmerksamkeit erhalten7,8,9,10,11,12,13,14 . Die Bedeutung der MSC-MΦ-Interaktion bei der Behandlung entzündlicher Erkrankungen wird durch die Tatsache unterstrichen, dass die Depletion von Monozyten/Makrophagen die therapeutischen Wirkungen von MSC in Tiermodellenaufhebt 8. Hier liegt der Fokus auf der Zellkontakt-Interaktion des MSC mit MΦ. MSC haben die Fähigkeit, den Phänotyp von MΦ zu regulieren, indem sie den Wechsel von entzündlichen zu entzündungshemmenden Reaktionen fördern, was zu Gewebereparaturaktivitätenführt 8,9,10,11, und es wurde viel getan, um diese Regulationsmechanismen zu demonstrieren. Unter anderen Umständen kann MSC eine MΦ-getriebene Entzündungsreaktion12,13 unterstützen oder verschlimmern und die phagozytische Aktivität von MΦverbessern 14,15. Es besteht jedoch ein kritischer Mangel an vorhandenen Daten, die die Mechanismen und die Bedingungen identifizieren, unter denen MSC die phagozytische Aktivität von MΦ regulieren.
MΦ haben Familien von Rezeptoren, die entweder opsonisierte (Antikörper oder Komplement-beschichtete) oder nicht-opsonisierte Pathogene erkennen, die zu Phagozytose führen16. Die Aktivierung und Aktivität der letzteren ist weniger gut untersucht17. In einer nicht-entzündlichen In-vitro-Umgebung verstärken MSC die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Krankheitserregern13. Die Erkennung von nicht-opsonisierten Krankheitserregern durch MΦ kann jedoch nach Exposition gegenüber einer entzündlichen Umgebung, die von Lymphozyten während einer adaptiven Immunantwort produziert wird, reduziert werden. IFN-γ, das von natürlichen Killerzellen und Effektor-Lymphozyten freigesetzt wird, hat eine hemmende Wirkung auf die MΦ-Phagozytose von nicht opsonisierten Partikeln18. Ein Kokulturmodell wurde entwickelt, um die Mechanismen der MSC-Direktkontaktregulation der MΦ-Phagozytose zu untersuchen. Ziel des hier vorgestellten Experiments ist es, festzustellen, ob MSC die MΦ-Phagozytose von nicht-opsonisierten Erregern regulieren, nachdem MΦ IFN-γ ausgesetzt wurde (Abbildung 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Analyse der Phagozytose unter Verwendung von Biopartikeln, die an einen pH-empfindlichen Farbstoff konjugiert sind, ist ein relativ neues Werkzeug, das sich gegenüber herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln als vorteilhaft erwiesen hat12,19,20. Bei herkömmlichen fluoreszenzmarkierten Partikeln ist nur eine Endpunktanalyse möglich. Der Nachweis erfolgt mit Fluoreszenzmikroskopie und/oder Spektrofluorometrie nach dem…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NSF Major Research Instrument-Mechanismus unter den Fördernummern 1626093 und 1919583 unterstützt.
Materials
| 96 Well Black Polystyrene Microplate | MilliporeSigma | CLS3603-48EA | |
| 0.4% trypan blue solution | MilliporeSigma | T8154-20ML | |
| 15 mL and 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | ThermoFisher | 339653 | |
| 4-well Chambered Coverglass w/ non-removable wells | ThermoFisher | 155382PK | |
| Antibiotic-Antimycotic (100X) Gibco | ThermoFisher | 15240096 | |
| Axiobserver 7 Imaging System | Zeiss | ||
| Bovine Serum Albumin (BSA) | MilliporeSigma | A8806-1G | |
| Cell lifter | MilliporeSigma | CLS3008-100EA | |
| Culture flasks, tissue culture treated, surface area 75 cm2, canted neck, with cap, filtered | MilliporeSigma | C7231-120EA | |
| D1 ORL UVA [D1] | ATCC | CRL-12424 | Mouse MSC Cell Line |
| DMEM, High Glucose | ThermoFisher | 11965092 | |
| Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Hemocytometer | FisherScientific | 02-671-51B | |
| I-11.15 | ATCC | CRL-2470 | Mouse MΦ Cell Line |
| LADMAC Cell Line | ATCC | CRL-2420 | LADMAC cells secrete the growth factor colony stimulating factor 1 (CSF-1). |
| Live-Cell Imaging solution | ThermoFisher | A14291DJ | |
| PBS, pH 7.4 | ThermoFisher | 10010031 | |
| pHrodo Green Zymosan Bioparticles Conjugate | ThermoFisher | P35365 | |
| Recombinant Murine IFN-γ | Preprotech | 315-05 | |
| Spectramax i3X | Molecular Devices | ||
| Sterile Single Use Vacuum Filter Units, 250 mL, 0.2 µm | ThermoFisher | 568-0020 | |
| Sterile syringe filters, 0.2 micrometer | ThermoFisher | 723-2520 | |
| Tissue-culture treated culture dishes, 100 mm x 20 mm | MilliporeSigma | CLS430167-100EA | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | ThermoFisher | 25300054 |
References
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