Vækst, rensning og titrering af oncolytic Herpes Simplex Virus
Summary
I dette manuskript beskriver vi en simpel metode til vækst, rensning og titrering af den oncolytiske herpes simplex virus til præklinisk brug.
Abstract
Oncolytic virus (OVs), såsom oncolytic herpes simplex virus (oHSV), er en hastigt voksende behandlingsstrategi inden for kræft immunterapi. OVs, herunder oHSV, selektivt kopiere i og dræbe kræftceller (skåne sunde / normale celler), mens fremkalde anti-tumor immunitet. På grund af disse unikke egenskaber, oHSV-baserede behandlingsstrategier bliver i stigende grad anvendes til behandling af kræft, præklinisk og klinisk, herunder FDA-godkendte talimogene laherparevec (T-Vec). Vækst, rensning og titrering er tre væsentlige laboratorieteknikker for alle CV’er, herunder oHSV’er, før de kan anvendes til eksperimentelle undersøgelser. Dette papir beskriver en enkel trinvis metode til at forstærke oHSV i Vero-celler. Efterhånden som oHSV’er formere sig, producerer de en cytopatisk effekt (CPE) i Vero-celler. Når 90-100% af de inficerede celler viser en CPE, høstes de forsigtigt, behandles med benzonase og magnesiumchlorid (MgCl2), filtreres og underkastes rensning ved hjælp af saccharosegradientmetoden. Efter rensning bestemmes antallet af infektiøse oHSV (udpeget som plaquedannende enheder eller PPU’er) af en “plaque assay” i Vero-celler. Den heri beskrevne protokol kan anvendes til at forberede højtitler oHSV-bestand til in vitro-undersøgelser i cellekultur og in vivo-dyreforsøg.
Introduction
Oncolytic virus (OVs) er en ny og unik form for kræft immunterapi. CV’er selektivt kopiere i og lyse tumorceller (skåne normale / sunde celler)1, mens fremkalde anti-tumor immunitet2. Oncolytic herpes simplex virus (oHSV) er en af de mest omfattende undersøgt virus blandt alle OVs. Det er længst henne i klinikken, med Talimogene laherparepvec (T-VEC) er den første og eneste OV til at modtage FDA godkendelse i USA til behandling af avanceret melanom3. Ud over T-VEC testes mange andre gensplejsede oHSV’er præklinisk og klinisk i forskellige kræfttyper3,4,5,6,7,8. Den nuværende avancerede rekombinant DNA-bioteknologi har yderligere øget muligheden for at udvikle nye OHSV-kodning til terapeutiske transgener3,5. Et effektivt system af oHSV-formering, rensning og titerbestemmelse er kritisk, før nogen (nyudviklet) oHSV kan testes for in vitro- og in vivo-undersøgelser. Dette papir beskriver en simpel trinvis metode til oHSV-vækst (i Vero-celler), rensning (ved saccharose-gradientmetoden) og titrering (ved en oHSV-plakanalyse i Vero-celler) (Figur 1). Det kan let vedtages i enhver Biosafety Level 2 (BSL2) laboratorieindstilling for at opnå en viral bestand af høj kvalitet til prækliniske undersøgelser.
Vero, en afrikansk grøn abe nyrecelle linje, er den mest almindeligt anvendte celle linje for oHSV formering9,10,11,12,13 som Vero celler har en defekt antiviral interferon signalering vej14. Andre cellelinjer med inaktiveret stimulator af interferongener (STING) signalering kan også bruges til oHSV vækst12,13. Denne protokol bruger Vero celler til oHSV vækst og plak assay. Efter formering høstes, lyses og renses oHSV-inficerede celler, hvori lyserede celler først behandles med benzonasekerner for at nedbryde værtscelle-DNA, forhindre nukleinsyreproteinsammenlægning og reducere viskositeten af cellelysatet. Da korrekt aktivering af benzonase ofte kræver Mg2+, anvendes 1-2 mM MgCl2 i denne protokol15. Værtscelleaffaldet fra benzonasebehandlet cellelyat elimineres yderligere ved seriefiltrering før højhastigheds-saccharose-gradient centrifugering. En tyktflydende 25% saccharoseopløsningspude hjælper med at sikre en langsommere virusmigration gennem saccharoselaget, hvilket efterlader værtscellerelaterede komponenter i supernatanten og forbedrer dermed rensningen og begrænser virustabet i pellet16. Den rensede oHSV er derefter titreret på Vero celler, og viral plaques visualiseres af Giemsa farvning17 eller X-gal farvning (for LacZ kodning oHSVs)18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen starter med væksten af oHSV i lav-passage Vero celler. Sammenløbet af Vero celle monolayer bør ~ 80% på tidspunktet for virus podning som tilgroede celler kan udvikle stramme fiber strukturer, der kan reducere oHSV indrejse i Vero celler20. Når 90-100% CPE er observeret, fjernes dyrknings-supernatanten, cellerne høstes, genbruges i VB/supernatant (se trin 1.4.6), snap-frosne og opbevares ved -80 °C til senere rensning. Blaho og kolleger ansat en lidt anden metode til høst og op…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forskning i Saha lab blev delvist støttet af midler fra DOD (W81XWH-20-1-0702) og Dodge Jones Foundation-Abilene. Samuel D. Rabkin og Melissa R.M. Humphrey blev delvist støttet af NIH (R01 CA160762).
Materials
| 1.7 mL centrifuge tubes | Sigma | CLS3620 | |
| 15 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352097 | |
| 5 mL polypropylene tubes | Falcon | 352063 | |
| 50 mL polypropylene centrifuge tubes | Falcon | 352098 | |
| 6-well cell culture plates | Falcon | 353046 | |
| Benzonase Nuclease | Sigma | E8263-25KU | |
| Cell scraper | Fisher Scientific | 179693 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma | D2650-100ML | |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Corning | MT-10-013-CV | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Corning | MT-21-031-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH3007003 | |
| Giemsa Stain | Sigma | G3032 | |
| Glutaraldehyde | Fisher Scientific | 50-262-23 | |
| Glycerol | Sigma | G5516 | |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Corning | MT-21-021-CV | |
| High-Glucose Dulbecco’s Phosphate-buffered Saline | Sigma | D4031 | |
| Human immune globulin | Gamastan | NDC 13533-335-12 | |
| Magnesium chloride | Fisher Chemical | M33-500 | |
| Media Sterilization filter, 250 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| Media Sterilization filter, 500 mL | Nalgene, Fisher Scientific | 09-740-25C | |
| Neutral Red solution | Sigma | N4638 | |
| Paraformaldehyde | Fisher scientific | 15710S | |
| Plate rocker | Fisher | 88861043 | |
| Potassium Ferricyanide | Sigma | P8131 | |
| Potassium Ferrocyanide | Sigma | P9387 | |
| Sodium chloride | Fisher Chemical | S271-3 | |
| Sorvall ST 16R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75004381 | |
| Sorvall ST 21R Centrifuge | ThermoFisher Scientific | 75002446 | |
| Sterile Microcentrifuge Tubes with Screw Caps | Fisher Scientific | 02-681-371 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | BP220-1 | |
| Syringe Filter, 0.45 PVDF | MilliporeSigma | SLHV033RS | |
| Syringe Filter, 0.8 MCE | MilliporeSigma | SLAA033SS | |
| Syringe filter, 5 µm PVDF | MilliporeSigma | SLSV025LS | |
| T150 culture flask | Falcon | 355001 | |
| Tris-HCl | MP Biomedicals LLC | 816116 | |
| Ultrasonic water bath | Branson | CPX-952-116R | |
| X-gal | Corning | 46-101-RF |
References
- Harrington, K., Freeman, D. J., Kelly, B., Harper, J., Soria, J. -. C. Optimizing oncolytic virotherapy in cancer treatment. Nature Reviews Drug Discovery. 18 (9), 689-706 (2019).
- Zhang, S., Rabkin, S. D. The discovery and development of oncolytic viruses: are they the future of cancer immunotherapy. Expert Opinion on Drug Discovery. 16 (4), 391-410 (2021).
- Bommareddy, P. K., Peters, C., Saha, D., Rabkin, S. D., Kaufman, H. L. Oncolytic herpes simplex viruses as a paradigm for the treatment of cancer. Annual Review of Cancer Biology. 2 (1), 155-173 (2018).
- Peters, C., Rabkin, S. D. Designing herpes viruses as oncolytics. Molecular Therapy-Oncolytics. 2, 15010 (2015).
- Nguyen, H. -. M., Saha, D. The current state of oncolytic herpes simplex virus for glioblastoma treatment. Oncolytic Virotherapy. 10, 1-27 (2021).
- Koch, M. S., Lawler, S. E., Chiocca, E. A. HSV-1 oncolytic viruses from bench to bedside: an overview of current clinical trials. Cancers. 12 (12), 3514 (2020).
- Menotti, L., Avitabile, E. Herpes simplex virus oncolytic immunovirotherapy: the blossoming branch of multimodal therapy. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8310 (2020).
- Nguyen, H. M., Guz-Montgomery, K., Saha, D. Oncolytic virus encoding a master pro-inflammatory cytokine interleukin 12 in cancer immunotherapy. Cells. 9 (2), 400 (2020).
- Agarwalla, P. K., Aghi, M. K. Oncolytic herpes simplex virus engineering and preparation. Methods in Molecular Biology. 797, 1-19 (2012).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Sutter, S. O., Marconi, P., Meier, A. F. Herpes simplex virus growth, preparation, and assay. Methods in Molecular Biology. 2060, 57-72 (2020).
- Froechlich, G., et al. Integrity of the antiviral STING-mediated DNA sensing in tumor cells is required to sustain the immunotherapeutic efficacy of herpes simplex oncolytic virus. Cancers. 12 (11), 3407 (2020).
- Froechlich, G., et al. Generation of a novel mesothelin-targeted oncolytic herpes virus and implemented strategies for manufacturing. International Journal of Molecular Sciences. 22 (2), 477 (2021).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Molecular and Cellular Biology. 6 (6), 2279-2283 (1986).
- Gousseinoz, E., Kools, W., Pattnaik, P. Nucleic acid impurity reduction in viral vaccine manufacturing. BioProcess International. 12 (2), 59-68 (2014).
- Diefenbach, R. J., Fraefel, C. Herpes simplex virus: methods and protocols. Methods in Molecular Biology. , (2014).
- Hadi, A. M., et al. An experimental trial to prepared γ1 34.5 herpes simplex virus 1 immunogene by cloning technique. Systematic Review Pharmacy. 11 (5), 140-149 (2020).
- Kuroda, T., Martuza, R. L., Todo, T., Rabkin, S. D. Flip-Flop HSV-BAC: bacterial artificial chromosome based system for rapid generation of recombinant herpes simplex virus vectors using two independent site-specific recombinases. BMC Biotechnology. 6, 40 (2006).
- Motamedifar, M., Noorafshan, A. Cytopathic effect of the herpes simplex virus type 1 appears stereologically as early as 4 h after infection of Vero cells. Micron. 39 (8), 1331-1334 (2008).
- Blaho, J. A., Morton, E. R., Yedowitz, J. C. Herpes simplex virus: propagation, quantification, and storage. Current Protocols in Microbiology. , 1 (2005).
- Malenovska, H. The influence of stabilizers and rates of freezing on preserving of structurally different animal viruses during lyophilization and subsequent storage. Journal of Applied Microbiology. 117 (6), 1810-1819 (2014).
- Vahlne, A. G., Blomberg, J. Purification of herpes simplex virus. Journal of General Virology. 22 (2), 297-302 (1974).
- Sathananthan, B., Rodahl, E., Flatmark, T., Langeland, N., Haarr, L. Purification of herpes simplex virus type 1 by density gradient centrifugation and estimation of the sedimentation coefficient of the virion. APMIS: Acta Pathologica, Microbiologica, et Immunologica Scandinavica. 105 (3), 238-246 (1997).
- Mundle, S. T., et al. High-purity preparation of HSV-2 vaccine candidate ACAM529 is immunogenic and efficacious in vivo. PLoS One. 8 (2), 57224 (2013).
- Jiang, C., et al. Immobilized cobalt affinity chromatography provides a novel, efficient method for herpes simplex virus type 1 gene vector purification. Journal of Virology. 78 (17), 8994-9006 (2004).
- Grosche, L., et al. Herpes simplex virus type 1 propagation, titration and single-step growth curves. Bio-protocol. 9 (23), 3441 (2019).
- Svennerholm, B., et al. Separation of herpes simplex virus virions and nucleocapsids on Percoll gradients. Journal of Virological Methods. 1 (6), 303-309 (1980).
- Baer, A., Kehn-Hall, K. Viral concentration determination through plaque assays: using traditional and novel overlay systems. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (93), e52065 (2014).
- Miyatake, S., Iyer, A., Martuza, R. L., Rabkin, S. D. Transcriptional targeting of herpes simplex virus for cell-specific replication. Journal of Virology. 71 (7), 5124-5132 (1997).
- Fabiani, M., Limongi, D., Palamara, A. T., De Chiara, G., Marcocci, M. E. A novel method to titrate herpes simplex virus-1 (HSV-1) using laser-based scanning of near-infrared fluorophores conjugated antibodies. Frontiers in Microbiology. 8, 1085 (2017).
