JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

High-Throughput In Vitro Assay met behulp van patiënt-afgeleide tumor organoïden

Published: June 14, 2021
doi:
10.3791/62668
, , , , , , ,
1FUJIFILM Wako Bio Solutions Corporation, 2Medical-Industrial Translational Research Center,Fukushima Medical University, 3Department of Bioregulation and Pharmacological Medicine,Fukushima Medical University

Summary

Een zeer nauwkeurig in vitro high-throughput testsysteem werd ontwikkeld om geneesmiddelen tegen kanker te evalueren met behulp van patiënt-afgeleide tumororganoïden (BOB’s), vergelijkbaar met kankerweefsels, maar zijn ongeschikt voor in vitro high-throughput testsystemen met 96-well en 384-well platen.

Abstract

Van patiënten afgeleide tumororganoïden (BOB’s) wordt verwacht dat ze een preklinisch kankermodel zijn met een betere reproduceerbaarheid van de ziekte dan traditionele celkweekmodellen. BOB’s zijn met succes gegenereerd uit een verscheidenheid aan menselijke tumoren om de architectuur en functie van tumorweefsel nauwkeurig en efficiënt samen te vatten. BOB’s zijn echter ongeschikt voor een in vitro high-throughput assay-systeem (HTS) of celanalyse met behulp van 96-well of 384-well platen bij het evalueren van geneesmiddelen tegen kanker, omdat ze heterogeen van grootte zijn en grote clusters vormen in cultuur. Deze culturen en assays gebruiken extracellulaire matrices, zoals Matrigel, om tumorweefselsteigers te maken. Daarom hebben BOB’s een lage doorvoer en hoge kosten, en het was moeilijk om een geschikt testsysteem te ontwikkelen. Om dit probleem aan te pakken, werd een eenvoudiger en nauwkeuriger HTS vastgesteld met behulp van BOB’s om de potentie van geneesmiddelen tegen kanker en immunotherapie te evalueren. Een in vitro HTS werd gemaakt dat PDOs gebruikt die zijn vastgesteld uit solide tumoren gekweekt in 384-well platen. Een HTS werd ook ontwikkeld voor de beoordeling van antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteitsactiviteit om de immuunrespons weer te geven met behulp van BOB’s gekweekt in 96-well platen.

Introduction

Menselijke kankercellijnen worden algemeen aanvaard om de biologie van kanker te bestuderen en antikankermiddelen te evalueren. Deze cellijnen behouden echter niet noodzakelijkerwijs de oorspronkelijke kenmerken van hun bronweefsel, omdat hun morfologie, genmutatie en genexpressieprofiel tijdens de kweek gedurende lange perioden kunnen veranderen. Bovendien worden de meeste van deze cellijnen gekweekt in een monolaag of gebruikt als muriene xenografts, die geen van beide fysiek tumorweefsel vertegenwoordigen1,2. De klinische werkzaamheid van antikankermiddelen is dus mogelijk niet dezelfde als die waargenomen in kankercellijnen. Daarom zijn in vitro systemen ontwikkeld, zoals ex vivo assays met behulp van patiënt-afgeleide tumor xenografts of patiënt-afgeleide tumor organoïden (BOB’s) en tumor sferoïde modellen die de structuur en functie van tumorweefsels nauwkeurig reproduceren. Toenemend bewijs suggereert dat deze modellen de reactie van patiënten op antikankermiddelen voorspellen door direct vergelijkbaar te zijn met het overeenkomstige kankerweefsel. Deze in vitro systemen zijn opgezet voor verschillende tumorweefseltypes, en bijbehorende high-throughput assay systemen (HTS) voor drug screening zijn ook ontwikkeld3,4,5,6,7. Heterogene ex vivo organoïde culturen van primaire tumoren verkregen van patiënten of van patiënten afgeleide tumor-xenografts hebben de afgelopen jaren aanzienlijke tractie gekregen vanwege hun gemak van kweek en het vermogen om de complexiteit van cellen in het stromale weefsel te behouden8,9,10. Van deze modellen wordt verwacht dat ze het begrip van de biologie van kanker verbeteren en de evaluatie van de werkzaamheid van geneesmiddelen in vitrovergemakkelijken.

Een reeks nieuwe BOB’s zijn onlangs gemaakt van verschillende soorten tumorweefsel, aangeduid als F-PDO, in het kader van het Fukushima Translational Research Project. De BOB’s vormen grote celclusters met een morfologie die vergelijkbaar is met die van de brontumor en kunnen gedurende meer dan zes maanden worden gekweekt11. De vergelijkende histologie en uitgebreide genexpressieanalyses toonden aan dat de kenmerken van de BOB’s dicht bij die van hun brontumorweefsels liggen, zelfs na langdurige groei onder kweekomstandigheden. Verder werd voor elk type BOB in 96-well en 384-well platen een geschikt HTS opgesteld. Deze testen werden gebruikt om verschillende moleculair gerichte agentia en antilichamen te evalueren. Hier werden standaard chemotherapeutica (paclitaxel en carboplatine) gebruikt voor endometriumkanker geëvalueerd met behulp van F-BOB’s afgeleid van een patiënt die niet reageerde op paclitaxel en carboplatine. Dienovereenkomstig was de celgroei remmende activiteit van paclitaxel en carboplatine tegen deze BOB zwak (IC50: >10 μM). Bovendien heeft eerder onderzoek gemeld dat de gevoeligheid van sommige F-BOB’s voor chemotherapeutische middelen en moleculair gerichte middelen consistent is met de klinische werkzaamheid11,12,13. Ten slotte werden veranderingen in de hogere-ordestructuur van de BOB’s veroorzaakt door antikankermiddelen geanalyseerd met behulp van een driedimensionaal celanalysesysteem12,13. De resultaten van de evaluatie van middelen tegen kanker met behulp van een HTS op basis van BOB zijn vergelijkbaar met de klinische resultaten die voor deze middelen zijn verkregen. Hier wordt een protocol gepresenteerd voor een eenvoudiger en nauwkeuriger HTS dat kan worden gebruikt om de potentie van antikankermiddelen en immunotherapie te evalueren met behulp van de BOB-modellen.

Protocol

Alle experimenten met van de mens afgeleide materialen werden uitgevoerd onder de Verklaring van Helsinki en vooraf goedgekeurd door de ethische commissie van de Fukushima Medical University (goedkeuringsnummers 1953 en 2192; goedkeuringsdatums respectievelijk 18 maart 2020 en 26 mei 2016). Schriftelijke geïnformeerde toestemming werd verkregen van alle patiënten die de klinische monsters verstrekten die in deze studie werden gebruikt. 1. Cultuur van BOB’s OPMERKING: F-BOB’s vormen celclusters die een verscheidenheid aan heterogene morfologieën vertonen en groeien in suspensiecultuur(figuur 1). Bovendien kunnen F-BOB’s langer dan 6 maanden worden gekweekt en kunnen ze worden gecryopreserveerd voor toekomstig gebruik. Ontdooien van opgeslagen BOB’s (dag 0) Dooi en zaad BOB’s (bijv. RLUN007, longadenocarcinoom) op dag 0(figuur 1). Voeg eerst 15 ml medium voor BOB’s (zie materiaaltabel)met 1% B-27-supplement en 30 ng / ml epidermale groeifactor toe aan een steriele centrifugebuis van 50 ml. Nadat u de bevroren injectieflacon uit de opslag van vloeibare stikstof hebt verwijderd, roert u de BOB’s voorzichtig in een waterbad van 37 °C gedurende 2 minuten. Verwijder vervolgens de injectieflacon uit het waterbad, veeg de injectieflacon af met 70% ethanol en verplaats de injectieflacon vervolgens naar een biologische veiligheidskast. Breng de inhoud van de injectieflacon over naar de buis met 15 ml medium voor BOB’s. Meng de BOB’s en het medium door vijf keer voorzichtig op en neer te pipetteren met een 3 ml transferpipet. Centrifugeer de buis gedurende 3 minuten bij 200 x g bij ~25 °C en gooi het supernatant weg. Resuspend de BOB-pellet in 5 ml vers medium en breng over in een kolf van25 cm (zie Materiaaltabel) met voorzichtig pipetteren. Kweek ten slotte de BOB’s in een incubator bij 37 °C in 5% CO2. Verander het medium twee keer per week (dagen 3-7). Centrifugeer de BOB-suspensie om de celclusters neer te slaan en vervang 4 ml van het medium (80% volume). Resuspend de cellen in het verse medium.OPMERKING: De meeste RLUN007 worden weergegeven als celclusters met een diameter van 100-500 μm. Wanneer de kleur van fenolrood in het medium verandert in geel zoals weergegeven in figuur 1A,vervangt u het medium vaker. Als het medium geel wordt op de dag na vervanging en elk celcluster samensmelt tot grotere clusters met een diameter van >500 μm, passage in een splitverhouding van 1:2. Subcultuur (dag 8-28) van BOB’sOPMERKING: Gezien de moeilijkheid om het aantal afzonderlijke cellen daadwerkelijk te meten, wordt de timing van passage bepaald op basis van een geschikte celclusterdichtheid en de grootte van de BOB-pellet na centrifugering (figuur 1B). In het geval van RLUN007 bereikt het volume van de BOB-pellet ongeveer 2 weken na het ontdooien 30μL (verzadigde dichtheid in 25 cm 2 kolven). Breng voor de overbrenging van één kolf van25 cm 2 naar twee kolven van25 cm 2 (P1) de BOB-suspensie over in een centrifugebuis en centrifugeer bij 200 x g gedurende 2 minuten bij ongeveer 25 °C. Schat het volume van de BOB-pellet en gooi het supernatant weg. Resuspend de BOB-pellet met behulp van een pipet van 5 ml in 5 ml vers medium. Pipetteer zachtjes vijf keer op en neer bij lage snelheid. Breng vervolgens de helft van het volume van de BOB-suspensie (2,5 ml) over in twee kolven en voeg 2,5 ml vers medium toe aan elke kolf. Kweek de cellen bij 37 °C in 5% CO2. Breng voor de overdracht van twee kolven van25 cm 2 naar één kolf van 75 cm2 (P2) de BOB-suspensie van twee kolven over in twee centrifugebuizen en centrifugeer de BOB bij 200 x g gedurende 2 minuten bij ongeveer 25 °C. Schat vervolgens het volume van de BOB-pellet en resuspend de pellet in 2,5 ml vers medium (per buis). Meng daarna de BOB-suspensie in de ene buis met die in de andere en breng deze over in een kolf van 75 cm2 met 10 ml vers medium. Kweek de cellen bij 37 °C in 5% CO2. Breng de subgekweekte BOB’s ongeveer 1 week na de eerste passage over van tweekolven van 25 cm 2 naar één kolf van 75 cm 2 (figuur 1C). 2. Groeiremming HTS OPMERKING: De groei remmende activiteit van antikankermiddelen tegen BOB’s wordt geëvalueerd door het intracellulaire ATP-gehalte te meten, zoals weergegeven in figuur 2. Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbare testkit voor de levensvatbaarheid van cellen (zie Tabel met materialen). Kweek op dag 0 de BOB’s (bijv. RLUN007) in kolven totdat voldoende celclusters beschikbaar zijn voor de test. Breng een dag voor het zaaien de BOB-suspensie over van een kolf van 75 cmen 2 naar een buis van 15 ml en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 200 x g om het volume van de BOB-pellet te meten. Breng de BOB-pellet vervolgens opnieuw op in 15 ml vers medium en breng deze terug in een kolf van 75 cm2. Kweek de cellen bij 37 °C in 5% CO2.OPMERKING: Het vereiste volume van de BOB-pellet is afhankelijk van de verdunningssnelheid van elke BOB en het aantal 384-putplaten dat voor de test is gebruikt. Voor RLUN007 is een celpelletvolume van 200 μL nodig voor het zaaien in tien 384-wellplaten. Op dag 1 (24 uur na het vervangen van het medium) hakt u de BOB’s met behulp van celfragmentatie- en dispersieapparatuur (zie Materiaaltabel)met een filterhouder met een meshfilter van 70 μm. Verdun vervolgens 15 ml van de BOB-suspensie met 10x. Zaad 40 μL van de BOB-suspensie in 384-well ultra-low attachment sferoïde (ronde bodem) microplaten (zie Tabel met materialen) met behulp van een celsuspensiedispenser (zie Materialentabel).OPMERKING: Voor het fijnhakken van celclusters wordt aanbevolen om de in de handel verkrijgbare apparatuur voor celfragmentatie en -dispersie te gebruiken (zie Materiaaltabel). Behandel de BOB’s na 24 uur na het zaaien (dag 2) met 0,04 μL testmiddeloplossingen bij eindconcentratiebereiken van 20 μM tot 1,0 nM (10 seriële verdunningen) met behulp van een vloeistofhandler (zie Materiaaltabel). Voeg op dag 8 (144 uur na behandeling met de teststof) intracellulair ATP-meetreagens toe aan de testputten. Meng de platen met een mixer en incubeer gedurende 10 min bij 25 °C. Meet het intracellulaire ATP-gehalte als luminescentie met behulp van een plaatlezer (zie Tabel met materialen). Om de levensvatbaarheid van de cel te berekenen, deelt u de hoeveelheid ATP in de testputten door die in de controleputten die het voertuig bevatten, waarbij de achtergrond wordt afgetrokken. Om de groeisnelheid over 6 dagen te berekenen, deelt u de hoeveelheid ATP in de voertuigcontroleputten door die in de voertuigcontroleputten 24 uur na het zaaien. Bereken de 50% remmende concentratie (IC50)en oppervlakte onder de curve (AUC) waarden uit de dosis-responscurven met behulp van biologische data-analyse software (zie Tabel van materialen). De Z-factor is een dimensieloze parameter die varieert van 1 (oneindige scheiding) tot <0, gedefinieerd als Z = 1 – (3σc+ + 3σc-) / |μc+ – μc-|, waarbij σc+, σc-, μc+, en μc- de standaarddeviaties (σ) en gemiddelden (μ) zijn van respectievelijk de hoge (c+) en lage (c−) controles14. 3. HTS met een celpluk- en beeldvormingssysteem voor groeiremming OPMERKING: Als er een grote afwijking is (wanneer de variatiecoëfficiënt [CV] bij de test meer dan 20% is) in de gegevens met behulp van protocol 2, kunnen BOB’s van een geselecteerde grootte worden gezaaid in 96-well of 384-well platen met behulp van een cel picking- en beeldvormingssysteem(Figuur 2). Het protocol is hetzelfde als het protocol dat is beschreven in stap 2.1 en 2.2 in de vorige sectie. Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbaar cell picking- en imaging-systeem (zie Tabel met materialen). Stel op dag 1 een 384-well ultra-low attachment sferoïde microplaat met 40 μL medium /well als een bestemmingsplaat in op het cell picking- en imaging-systeem. Vul de plukkamer (zie Tabel met materialen)met 6 ml kweekmedium en centrifugeer gedurende 2 minuten bij 1.500 x g om luchtbellen te verwijderen. Voeg de BOB’s die in het medium zijn gesuspendeerd (BOB-pelletvolume, 4 μL) toe aan de plukkamer en stel deze in op het systeem. Zet de kamer minstens 1 minuut, gevolgd door dispersie, zodat de celclusters zich op de bodem van de kamer nestelen; voer vervolgens een scan van de kamer uit. Stel de plukgrootte in op 140-160 μm (gebied 15.386-20.000 μm2) op het systeem voor automatische selectie van celclusters. Controleer vervolgens de kwaliteit van de geselecteerde celclusters op de gescande afbeeldingen en breng tien celclusters per put over met behulp van pluktips (zie Tabel met materialen) naar de bestemmingsplaat. Voer de protocolstappen uit vanaf stap 2.3. 4. HTS voor antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit OPMERKING: Deze stap wordt uitgevoerd met behulp van een in de handel verkrijgbaar systeem (zie Tabel met materialen), een elektrisch impedantiemeetinstrument. Het wordt gebruikt om cytolyse van BOB’s te evalueren door antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit (ADCC) met monoklonale antilichamen en natural killer (NK) cellen(Figuur 3). NK-cellen worden geproduceerd uit perifere mononucleaire bloedcellen met behulp van de NK-celproductiekit (zie Materiaaltabel), volgens de instructies van de fabrikant. Meting van ADCC-activiteit Bestrijk op dag 0 een 96-well plaat (zie Tabel met materialen) met 50 μL 10 μg/ml fibronectineoplossing (0,5 μg/putje) bij 4 °C gedurende de nacht. Voeg op dag 1, na het verwijderen van de fibronectine-oplossing, 50 μL van het kweekmedium toe aan elke put om de achtergrondimpedantie te meten. Voeg voorafgaand aan het zaaien 5 ml celkweekdissociatiereagens (zie materiaaltabel)toe aan de BOB’s (RLUN007: 100 μL van de BOB-pellet in een kolf van 75 cm2) en incubeer in een CO2-incubator bij 37 °C gedurende 20 minuten om de BOB’s te dispergeren. Om trypsinisatie te stoppen, voegt u 5 ml medium toe, centrifugeert u en verwijdert u het dissociatiereagens. Spoel de BOB’s af met vers medium en filtreer door een celzeef van 40 μm (zie Materiaaltabel). Tel het aantal cellen met behulp van een cel levensvatbaarheid analyzer (zie Tabel met materialen). Breng de BOB-suspensie over naar een reservoir en meng met behulp van een meerkanaals pipettor. Voeg de BOB-suspensie toe in putjes op 5 x10 4 cellen/put in een 96-putplaat. Elke put bevat een eindvolume van 100 μL. Plaats de plaat vervolgens gedurende 30 minuten in een biologische veiligheidskast bij ongeveer 25 °C. Breng de plaat over naar het instrument in een CO2-incubator bij 37 °C. Registreer elke 15 minuten veranderingen in de impedantiesignalen als de celindex. Ontdooi de NK-cellen in een waterbad van 37 °C op dezelfde dag als de BOB-zaaiing. Breng de cellen van de injectieflacon over naar een buis van 15 ml met 10 ml medium voor NK-cellen (zie materiaaltabel)en centrifugeer bij 300 x g gedurende 5 minuten bij ongeveer 25 °C. Gooi het supernatant weg en resuspend de celkorrel in 10 ml vers medium. Pas na het tellen van de cellen de celdichtheid aan op 1 x10 6 cellen/ml en breng over naar een kolf van 75 cm2. Kweek de NK-cellen in een 5% CO2-incubator bij 37 °C. Bereid op dag 2 de antilichaamoplossingen (fosfaat-gebufferde zoutoplossing) op 10 maal de eindconcentratie in steriele V-bottom 96-well platen. Verwijder 60 μL medium uit elke put en voeg 10 μL trastuzumab of cetuximab-oplossing (10 μg/ml, 1 μg/ml en 0,1 μg/ml) toe aan de BOB’s. Breng de platen terug naar het instrument in een couveuse en noteer de celindex gedurende 1 uur. Breng de NK-celsuspensie over in een buis van 50 ml en tel het celnummer. Centrifugeer de cellen gedurende 5 minuten bij 300 x g en pas de NK-celdichtheid aan op 1 x10 6 cellen/ml en 2 x 106 cellen/ml met het medium voor de BOB’s. Voeg 50 μL NK-celsuspensie toe aan de effectorcellen (NK) met een doelcelverhouding (RLUN007) van 1:1 of 2:1. De uiteindelijke concentraties van de antilichamen zijn 1 μg/ml, 0,1 μg/ml en 0,01 μg/ml. Houd de plaat gedurende 15 minuten op ongeveer 25 °C en breng de platen terug naar het instrument. Gegevensverzameling en -analyse Converteer de celindex naar procentuele cytolysewaarden met behulp van analysesoftware (zie Tabel met materialen). Het percentage cytolyse verwijst naar het percentage doelcellen dat wordt gedood door NK-cellen versus doelcellen (BOB’s) alleen als controle. Trek de celindices van de putjes die alleen NK-cellen bevatten af van de index van de monsterputten op elk tijdstip. Normaliseer elke waarde naar de celindex onmiddellijk vóór de toevoeging van antilichamen. Converteer de genormaliseerde celindex naar procent cytolyse met behulp van de volgende vergelijking: % cytolyse = (1 – genormaliseerde celindex [monsterputten]) / genormaliseerde celindex (doel alleen putten) x 100.

Representative Results

Een zeer nauwkeurige HTS werd ontwikkeld met behulp van BOB’s en 384-well microplaten om antikankermiddelen te evalueren, en de ontwikkeling van een HTS voor elke BOB werd eerder gemeld10,11,12,13. De prestaties van de HTS werden geëvalueerd door de cv’s en de Z’-factor te berekenen. De Z’-factor is een algemeen aanvaarde methode voor validatie van testkwaliteit en -prestaties, en de test is geschikt voor HTS als deze waarde >0,514is. De controledatumpunten in de 384-well plaattest met behulp van RLUN007 vertoonden weinig variabiliteit, met CV-waarden van 5,8% en berekende Z’-factoren van 0,83, zoals weergegeven in figuur 4. Deze resultaten geven aan dat deze test hoge prestaties heeft voor HTS. Om de gevoeligheid van BOB’s voor middelen tegen kanker met HTS te onderzoeken, werd groeiremming beoordeeld met behulp van RLUN007 behandeld met acht antikankermiddelen, met name epidermale groeifactorreceptor (EGFR) -remmers (afatinib, erlotinib, gefitinib, lapatinib, osimertinib en rociletinib) en paclitaxel, die standaard klinische behandelingen zijn voor niet-kleincellige longkanker, en mitomycine C als positieve controle. De IC50- en AUC-waarden van de middelen tegen kanker voor elke BOB zijn weergegeven in figuur 4. De RLUN007 vertoonde een hoge sensitiviteit (IC50 < 2 μM, AUC < 282) voor alle EGFR-remmers en andere middelen tegen kanker. Sigmoïde curven berekend voor alle gegevens gaven aan dat de groei remmende activiteit van de antikankermiddelen nauwkeurig kon worden gemeten. Het celverzamel- en beeldvormingssysteem wordt gebruikt wanneer de gegevens aanzienlijk variëren met behulp van de bovenstaande methodologie. Het celpicking- en beeldvormingssysteem, dat celclusters nauwkeurig kiest zonder ze te beschadigen, maakt nauwkeurige HTS-testen mogelijk door de celclustergrootte uit te lijnen om celresten uit het testsysteem uit te sluiten. Wanneer het systeem niet werd gebruikt, was de CV-waarde 26,0% en de Z’-factorwaarde 0,23 (gegevens niet weergegeven). De CV- en Z’-factorwaarden werden echter verbeterd met respectievelijk 6,4% en 0,81 met behulp van het systeem. Om cytolyse van BOB’s met ADCC-activiteit te onderzoeken met behulp van het elektrische impedantiemeetinstrument, dat het aantal, de morfologie en de aanhechting van cellen gedurende een lange duur bewaakt, werden veranderingen in impedantiesignalen beoordeeld met behulp van RLUN007 behandeld met de antilichamen (trastuzumab en cetuximab) en NK-cellen als effectorcellen in een 96-well plaat. Vergeleken met de controle die alleen uit doelcellen bestond, nam het percentage cytolyse met de tijd toe. Het bereikte 45% of 75% na 6 uur bij een E: T-verhouding van 1: 1 (figuur 5A,C) of 2: 1 ( figuur5B,D) zonder de antilichamen. NK-celgemedieerde cytolyse met trastuzumab was ongeveer 60% en 90% in een verhouding van respectievelijk1:1 (figuur 5A,1 μg/ml) en 2:1(figuur 5B,1 μg/ml) na 6 uur. Cetuximab had daarentegen een dosisafhankelijk effect op NK-celgemedieerde cytolyse (figuur 5C,D). Bij de hoogste concentratie cetuximab werden RLUN007 vernietigd bij 90% en 100% bij een verhouding van respectievelijk 1:1 en 2:1 (figuur 5C,D). Het effect van trastuzumab was zwakker dan dat van cetuximab, met slechts 60% cytotoxiciteit. Deze resultaten geven aan dat het PDO-testsysteem de ADCC-activiteit kan evalueren met behulp van real-time op impedantie gebaseerde technologie. Figuur 1: Kritische punten voor de BOB-cultuur. (A) Kleurverandering in het medium. (B) Meting van de hoeveelheid BOB’s van de pelletgrootte door een centrifugebuis met de BOB’s te bekleden met buizen die zijn gemarkeerd op niveaus van 50-200 μL. (C) BOB-dichtheid. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Samenvatting van het protocol dat is gebruikt om een high-throughput testsysteem te maken met behulp van 384-well microplaten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 3: Samenvatting van het protocol voor high-throughput assay van ADCC-activiteit. ADCC, antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit; NK, natuurmoordenaar. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: High-throughput testsysteem voor groeiremming met antikankermiddelen. Dosis-responscurve van RLUN007 op antikankermiddelen. De gehakte BOB’s werden gezaaid in platen met 384 putten. Deze werden gedurende 6 dagen behandeld met tien verschillende concentraties antikankermiddelen (tussen 10 μM en 1,5 nM). De gegevens vertegenwoordigen de gemiddelde ± standaarddeviatie van drievoudige experimenten. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: High-throughput assay voor ADCC-activiteit. (A,B) Trastuzumab. (C,D) Cetuximab. (A,C) Een verhouding van 1:1 tussen RLUN007 en effectorcellen. (B,D) Cytolyse met een verhouding van RLUN007: effectorcellen van 1:2. De activiteit werd gemeten 12 uur na de toevoeging van de effectorcellen. De gegevens worden gepresenteerd als de gemiddelde ± standaarddeviatie van drie replicerende monsters. ADCC, antilichaamafhankelijke cellulaire cytotoxiciteit. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Discussion

Het unieke kenmerk van BOB’s is dat ze niet enzymatisch worden gescheiden in afzonderlijke cellen tijdens kweek of assay en celclusters in cultuur behouden. Daarom kan het aantal cellen niet nauwkeurig worden geteld onder een microscoop. Om dit probleem op te lossen, wordt het aantal cellen visueel bepaald door een centrifugebuis met de cellen te bekleden met buizen gemarkeerd met niveaus voor 50-200 μL (figuur 1B). Bovendien, omdat het moeilijk is om het pelletvolume van celclusters gekweekt in een 25 cm2 kolf visueel te meten, werd de tijd van passage bepaald met behulp van de gemiddelde kleurverandering van rood naar geel en de merkbare toename van enkele cellen of puinvergelijkt met de tijd van voorbijgaan als indicatoren (Figuur 1A,C). Dit is het punt van passaging voor BOB’s. De hoeveelheid BOB-pellets wordt visueel gemeten na centrifugeren bij elke mediumverandering. Wanneer het pelletvolume stopt met toenemen en het medium geel wordt op de dag na mediumvervanging, wordt het medium beschouwd als verzadigd met dichtheid en wordt passaging uitgevoerd. Het pelletvolume wordt voor elke BOB gedefinieerd. Als de BOB’s zich niet vermenigvuldigen, wordt de hoeveelheid medium veranderd van 80% naar 50% op het moment van mediumuitwisseling en wordt de dichtheid van BOB’s in de cultuur verhoogd.

Er is een HTS ontwikkeld die geschikt is voor BOB’s. De doorvoer is ten minste tien tot twintig 384-putplaten uitgevoerd met behulp van één 75 cm2-kolf van BOB, en het aantal verwerkte platen per dag is ten minste 50. Bovendien zijn de resultaten van de evaluatie van verschillende geneesmiddelen tegen kanker door HTS met behulp van BOB’s al gerapporteerd.

Bij het uitvoeren van HTS wordt verstopping van het mesh-filter veroorzaakt door het fijnhakken van de F-BOB’s met behulp van de celfragmentatie- en dispersieapparatuur in eerste instantie aangepakt door de maaswijdte van het filter te wijzigen in 100 μm. De volgende stap is het verminderen van het volume van de BOB-suspensie die op het glazen vat wordt aangebracht. Bij de bereiding van teststofoplossingen voor HTS worden verbindingen met een laag molecuulgewicht gewoonlijk opgelost in dimethylsulfoxide en worden de antilichamen opgelost in een fosfaatbufferde zoutoplossing. Het geschikte oplosmiddel wordt als teststof gebruikt en de controlegegevens worden verkregen uit het gebruikte oplosmiddel.

Hieronder volgt een beschrijving van hoe om te gaan met variabiliteit in de testgegevens. Als er grote variatie is in de gegevens in de test met behulp van 384-well platen, moet de testplaat worden gewijzigd in een 96-well plaatformaat. De BOB-verdunningsfactor (aantal gezaaide celclusters) wordt ook onderzocht na het zaaien van de plaat. Ten slotte kan het celpicking- en beeldvormingssysteem worden gebruikt om de grootte van BOB’s voor de test te selecteren. Voordat BOB’s aan de kamer worden toegevoegd, moeten enkele cellen en kleine celclusters worden verwijderd door middel van centrifugeren met lage snelheid om BOB’s correct te kunnen herkennen. Als afzonderlijke cellen of kleine celclusters zichtbaar zijn na het toevoegen van BOB’s aan de kamer, kunnen meerdere dispersies worden uitgevoerd om de afzonderlijke cellen te verwijderen. Vervolgens, hoewel het celpicking- en beeldvormingssysteem een functie heeft waarmee de plaat warm kan worden gehouden, wordt deze functie niet gebruikt vanwege de verdamping van het kweekmedium wanneer het systeem gedurende een lange periode werkt. Ten slotte is het volume van celclusters onbekend omdat het wordt herkend door een vlakke afbeelding. Bovendien, als twee of meer BOB’s elkaar overlappen, kan een enkele BOB niet correct worden herkend. Het is echter mogelijk om ongewenste BOB’s te verwijderen met behulp van de verwijderfunctie door ze na de verhuizing op de gescande afbeelding te controleren.

Het elektrische impedantiemeetinstrument wordt over het algemeen gebruikt voor aanhangende doelkankercellen om veranderingen in impedantie tijdens celproliferatie te volgen. Daarom wordt geen verandering in de celindex van niet-adherente BOB’s gedetecteerd. In een poging om dit probleem op te lossen, is het noodzakelijk om de zaaiomstandigheden zoals BOB-dichtheid en enzymatische behandeling (celdissociatie-enzym en behandelingstijd) te onderzoeken, afhankelijk van het type BOB. De putten in de plaat moeten ook worden bedekt met een geschikte extracellulaire matrix voor het zaaien van BOB’s. BOB’s worden gezaaid zonder enzymatische behandeling, afhankelijk van het type BOB. RLUN007 werd gebruikt om de impedantie te meten door de BOB’s op een 96-well plaat te zaaien na ze te dispergeren door enzymatische behandeling. RLUN007 werd gedurende 20 minuten bij 37 °C behandeld met het celkweekdissociatiereagens om de cellen te dispergeren en aan de putjes van een 96-well plaat te bevestigen. Aangezien gedissocieerde RLUN007-cellen onmiddellijk aggregaten vormen, is het wenselijk om vlak na filtratie op de platen te zaaien met behulp van een zeef. Na het overbrengen van de celsuspensie van de buis naar een reservoir, werd het reservoir twee tot drie keer voorzichtig van rechts naar links verplaatst en vijf keer op en neer gepipetteerd voordat het op de plaat werd gezaaid. De ophanging werd ook gemengd met elke toevoeging aan de put. De plaat werd vervolgens gedurende 30 minuten (voor BOB’s) of 15 minuten (voor NK-cellen) in een biologische veiligheidskast geplaatst om de cellen gelijkmatig in de put te laten verdelen. Het tweede belangrijke punt is dat behandeling met antilichamen en NK-cellen moet worden getimed voordat de celindex een plateau bereikt en de waarde niet minder dan 0,5 is. In het geval van RLUN007 is de optimale tijd om de test te starten 20-22 uur na het plateren en het celnummer voor zaaien is 5 x 104 cellen / put.

Over het algemeen gebruiken de kweek en testen voor tumororganoïden extracellulaire matrices zoals Matrigel om tumorweefselsteigers of enzymen zoals trypsine en collagenase te maken om de organoïden te verstoren3,4,5,6,7. Het voordeel van deze methode is dat er geen extracellulaire matrix of enzymatische behandeling nodig is tijdens het kweken en testen (behalve voor assays met behulp van het elektrische impedantiemeetinstrument), wat de arbeidsvereisten en -kosten aanzienlijk vermindert. Bovendien is deze methode relatief eenvoudig aan te passen aan HTS-testsystemen en verschillende meetsystemen. Het gebruik van een extracellulaire matrix is echter wenselijk voor sommige onderzoeksdoeleinden omdat het kan fungeren als een steiger voor cellen en morfogenese, differentiatie en homeostase in weefsels kan beïnvloeden.

In deze studie werden BOB’s (RLUN007) met een EGFR-mutatie (L858R) die klinisch gevoelig is voor EGFR-remmers en een hoge expressie van het EGFR-gen (gegevens niet getoond) gebruikt om EGFR-remmers te evalueren. Er werd aangetoond dat de gevoeligheid van RLUN007 voor EGFR-remmers hoger was dan die van andere van longkanker afgeleide F-BOB’s13 (figuur 4). Een HTS met behulp van BOB’s, die de kenmerken van tumorweefsel behouden, is dus superieur voor de evaluatie van potentiële antikankermiddelen en biedt mogelijkheden voor geneesmiddelenbeoordeling en vooruitgang in gepersonaliseerde geneeskunde. Hoewel HTS geschikt is voor de eerste screening van middelen, reproduceert het de tumormicro-omgeving niet en kan het dus de werkzaamheid van geneesmiddelen in vivoniet evalueren . Daarom is een in vitro systeem dat menselijk tumorweefsel in vivo kan nabootsen door co-kweek met vasculaire endotheelcellen en andere stromale cellen of organ-on-a-chip-technologie bij afwezigheid van diermodellen nu in ontwikkeling.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We willen de patiënten bedanken die de klinische monsters hebben verstrekt die in dit onderzoek zijn gebruikt. Dit onderzoek wordt ondersteund door subsidies van het Translational Research Program van de prefectuur Fukushima.

Materials

384-well Ultra-Low Attachment Spheroid Microplate Corning 4516 Plates for HTS
40-µm Cell Strainer Corning 352340
AdoptCell-NK kit Kohjin Bio 16030400 Kit for NK cell production
Cancer Cell Expansion Media plus Fujifilm Wako Pure Chemical 032-25745 Medium for F-PDO
ALyS505N-175 Cell Science & Technology institute 10217P10 Medium for NK cells
CELL HANDLER Yamaha Motor – Cell picking and imaging system
CellPet FT JTEC – Cell fragmentation and dispersion equipment
CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay Promega G9683 Cell viability luminescent assay, intracellular ATP measuring reagent
Echo 555 Labcyte – Liquid handler
EnSpire PerkinElmer – Plate reader
E-plate VIEW 96 Agilent 300601020 Plates are specifically designed to perform cell-based assays with the xCELLigence RTCA System
Fibronectin Solution Fujifilm Wako Pure Chemical 063-05591 Plate coating for xCELLigence RTCA System
F-PDO Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International – The F-PDO can be purchased from Fujifilm Wako Pure Chemicals or Summit Pharmaceuticals International
Morphit software, version 6.0 The Edge Software Consultancy Biological data analysis software
Multidrop Combi ThermoFisher Scientific 5840300 Cell suspension dispenser
Precision Chamber Yamaha Motor JLE9M65W230 Chamber for picking cell clusters using CELL HANDLER
Precision Tip Yamaha Motor JLE9M65W300 Micro tip for picking cell clusters using CELL HANDLER
RLUN007 Fujifilm Wako Pure Chemical or Summit Pharmaceuticals International Lung tumor derived F-PDO
TrypLE Express ThermoFisher Scientific 12604021 Cell culture dissociation reagent
Ultra-Low Attachment 25 cm² Flask Corning 4616 Culture flask for PDO
Ultra-Low Attachment 75 cm² Flask Corning 3814 Culture flask for PDO
Vi-CELL XR Cell Viability Analyzer System Beckman coulter – Cell viability analyzer
xCELLigence immunotherapy software, version 2.3 ACEA Bioscience – Analysis software for xCELLigence RTCA System
xCELLigence RTCA System ACEA Bioscience – Electrical impedance measuring instrument for cytolysis
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Sharma, S. V., Haber, D. A., Settleman, J. Cell line-based platforms to evaluate the therapeutic efficacy of candidate anticancer agents. Nature Reviews Cancer. 10 (4), 241-253 (2010).
  2. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (10), 647-664 (2014).
  3. Xu, H., et al. Organoid technology and applications in cancer research. Journal of Hematology & Oncology. 11 (1), 116 (2018).
  4. Palechor-Ceron, N., et al. Conditional reprogramming for patient-derived cancer models and next-generation living biobanks. Cells. 8 (11), 1327 (2019).
  5. Broutier, L., et al. Human primary liver cancer-derived organoid cultures for disease modeling and drug screening. Nature Medicine. 23 (12), 1424-1435 (2017).
  6. Du, Y., et al. Development of a miniaturized 3D organoid culture platform for ultra-high-throughput screening. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 630-643 (2020).
  7. van de Wetering, M., et al. Prospective derivation of a living organoid biobank of colorectal cancer patients. Cell. 161 (4), 933-945 (2015).
  8. Meijer, T. G., Naipal, K. A., Jager, A., van Gent, D. C. Ex vivo tumor culture systems for functional drug testing and therapy response prediction. Future Science OA. 3 (2), (2017).
  9. Inoue, A., et al. Current and future horizons of patient-derived xenograft models in colorectal cancer translational research. Cancers (Basel). 11 (9), 1321 (2019).
  10. Hum, N. R., et al. Comparative molecular analysis of cancer behavior cultured in vitro, in vivo, and ex vivo. Cancers (Basel). 12 (3), 690 (2020).
  11. Tamura, H., et al. Evaluation of anticancer agents using patient-derived tumor organoids characteristically similar to source tissues. Oncology Reports. 40 (2), 635-646 (2018).
  12. Takahashi, N., et al. An in vitro system for evaluating molecular targeted drugs using lung patient-derived tumor organoids. Cells. 8 (5), 481 (2019).
  13. Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
  14. Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A simple statistical parameter for use in evaluation and validation of high throughput screening assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).

Tags

Patient-derived Tumor OrganoidsHigh-throughput In Vitro AssayCell Analysis2D Culture3D CultureMolecular Targeted DrugsCell Suspension384-well MicroplateLiquid HandlerCell Fragmentation And Dispersion Instrument

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Higa, A., Takahashi, N., Hiyama, G., Tamura, H., Hoshi, H., Shimomura, K., Watanabe, S., Takagi, M. High-Throughput In Vitro Assay using Patient-Derived Tumor Organoids. J. Vis. Exp. (172), e62668, doi:10.3791/62668 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image