Um método eficiente para indução celular direcionada à hepatocito de células-tronco embrionárias humanas
Summary
Este manuscrito descreve um protocolo detalhado para diferenciação de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) em células funcionais semelhantes a hepatócitos (HLCs) complementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE).
Abstract
As funções potenciais das células semelhantes a hepatócitos (HLCs) derivadas de células-tronco embrionárias humanas (hESCs) têm grande promessa para modelagem de doenças e aplicações de rastreamento de medicamentos. Fornecido aqui é um método eficiente e reprodutível para diferenciação de hESCs em HLCs funcionais. O estabelecimento de uma linhagem de endoderm é um passo fundamental na diferenciação para os HLCs. Pelo nosso método, regulamos as principais vias de sinalização, suplementando continuamente a Activina A e CHIR99021 durante a diferenciação do HESC em endóderme definitivo (DE), seguido pela geração de células progenitoras hepáticas, e finalmente HLCs com morfologia hepatocitada típica em um método de estágio com reagentes completamente definidos. Os HLCs derivados do hESC produzidos por este método expressam marcadores específicos de palco (incluindo albumina, O receptor nuclear HNF4α e o polipeptídeo de cotransportamento de sódio (NTCP) e apresentam características especiais relacionadas a hepatócitos maduros e funcionais (incluindo coloração verde indocitana, armazenamento de glicogênio, coloração de hematoxilina-eosina e atividade CYP3), e pode fornecer uma plataforma para o desenvolvimento de aplicações baseadas em HLC no estudo de doenças hepáticas.
Introduction
O fígado é um órgão altamente metabólico que desempenha vários papéis, incluindo desoxidação, armazenamento de glicogênio, e secreção e síntese de proteínas1. Vários patógenos, drogas e herediidade podem causar alterações patológicas no fígado e afetar suas funções2,3. Os hepatócitos, como a principal unidade funcional do fígado, desempenham um papel importante nos sistemas de apoio hepático artificial e na eliminação da toxicidade medicamentosa. No entanto, o recurso dos hepatócitos humanos primários é limitado na terapia baseada em células, bem como na pesquisa de doenças hepáticas. Portanto, desenvolver novas fontes de hepatócitos humanos funcionais é uma importante direção de pesquisa no campo da medicina regenerativa. Desde 1998, quando foram estabelecidos4,os hESCs têm sido amplamente considerados pelos pesquisadores devido ao seu potencial de diferenciação superior (eles podem se diferenciar em vários tecidos em um ambiente adequado) e alto grau de autoconexibilidade, e assim fornecer células de origem ideais para fígados bioartificial, transplante de hepatocito e até mesmo engenharia de tecido hepático5.
Atualmente, a eficiência de diferenciação hepática pode ser muito aumentada enriquecendo o endodermo6. Na diferenciação de linhagem das células-tronco em endoderme, os níveis do fator de crescimento transformador β (TGF-β) sinalização e vias de sinalização WNT são os fatores-chave no nó do estágio de formação do endoderme. A ativação de um alto nível de sinalização TGF-β e WNT pode promover o desenvolvimento do endodermo7,8. Activin A é uma citocina pertencente à superfamília TGF-β. Portanto, a Activin A é amplamente utilizada na indução de endoderme de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (hiPSCs) e hESCs9,10. GSK3 é uma proteína de serina-threonina quinase. Pesquisadores descobriram que o CHIR99021, um inibidor específico do GSK3β, pode estimular sinais típicos de WNT, e pode promover a diferenciação de células-tronco sob certas condições, sugerindo que o CHIR99021 tem potencial para induzir a diferenciação de células-tronco no endóderme 11,12,13.
Aqui relatamos um método eficiente e reprodutível para induzir efetivamente a diferenciação dos hESCs em HLCs funcionais. A adição sequencial de Activin A e CHIR99021 produziu cerca de 89,7±0,8% de células SOX17 (marcador DE)positivos. Após serem ainda mais maturadas in vitro,essas células expressaram marcadores específicos hepáticos e exerceram morfologia semelhante a hepatocito (baseada na coloração de hematoxilina-eosina (H & E)) e funções, como absorção de verde indociina (ICG), armazenamento de glicogênio e atividade CYP3. Os resultados mostram que os hESCs podem ser diferenciados com sucesso em HLCs funcionais maduros por este método e podem fornecer uma base para pesquisas relacionadas a doenças hepáticas e triagem de medicamentos in vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos um método stepwise que induz os HLCs dos hESCs em três estágios. Na primeira etapa, Activin A e CHIR99021 foram utilizados para diferenciar os hESCs em DE. No segundo estágio, ko-DMEM e DMSO foram usados para diferenciar DE em células progenitoras hepáticas. No terceiro estágio, HZM mais HGF, OSM e hidrólio 21-hemisuccinato de sódio foram usados para continuar a diferenciar células progenitoras hepáticas em HLCs.
As seguintes etapas críticas devem ser levadas em …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciência Natural da China (No. 81870432 e 81570567 a X.L.Z.), (No. 81571994 para P.N.S.); a Fundação de Ciência Natural da Província de Guangdong, China (N. 2020A1515010054 para P.N.S.), Fundação Universidade Li Ka Shing Shantou (N. No. L1111 2008 para P.N.S.). Gostaríamos de agradecer ao Prof. Stanley Lin da Faculdade de Medicina da Universidade de Shantou por conselhos úteis.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M7522 | For hepatic progenitor differentiation |
| 488 labeled goat against mouse IgG | ZSGB-BIO | ZF-0512 | For IF,second antibody |
| 488 labeled goat against Rabbit IgG | ZSGB-BIO | ZF-0516 | For IF,second antibody |
| Accutase | Stem Cell Technologies | 7920 | For cell passage |
| Activin A | peproTech | 120-14E | For definitive endoderm formation |
| Anti – Albumin (ALB) | Sigma-Aldrich | A6684 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti – Human Oct4 | Abcam | Ab19587 | For IF, primary antibody |
| Anti – α-Fetoprotein (AFP) | Sigma-Aldrich | A8452 | For IF and WB, primary antibody |
| Anti -SOX17 | Abcam | ab224637 | For IF, primary antibody |
| Anti-Hepatocyte Nuclear Factor 4 alpha (HNF4α) | Sigma-Aldrich | SAB1412164 | For IF, primary antibody |
| B-27 Supplement | Gibco | 17504-044 | For definitive endoderm formation |
| BSA | Beyotime | ST023-200g | For cell blocking |
| CHIR99021 | Sigma-Aldrich | SML1046 | For definitive endoderm formation |
| DAPI | Beyotime | C1006 | For nuclear staining |
| DEPC-water | Beyotime | R0021 | For RNA dissolution |
| DM3189 | MCE | HY-12071 | For definitive endoderm formation |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320-033 | For cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 | For hepatic progenitor differentiation |
| DPBS | Gibco | 14190-144 | For cell culture |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | For hepatic progenitor differentiation |
| H&E staining kit | Beyotime | C0105S | For H&E staining |
| Hepatocyte growth factor (HGF) | peproTech | 100-39 | For hepatocyte differentiation |
| HepatoZYME-SFM (HZM) | Gibco | 17705-021 | For hepatocyte differentiation |
| Hydrocortisone-21-hemisuccinate | Sigma-Aldrich | H4881 | For hepatocyte differentiation |
| Indocyanine | Sangon Biotech | A606326 | For Indocyanine staining |
| Knock Out DMEM | Gibco | 10829-018 | For hepatic progenitor differentiation |
| Knock Out SR Multi-Species | Gibco | A31815-02 | For hepatic progenitor differentiation |
| Matrigel hESC-qualified | Corning | 354277 | For cell culture |
| MEM NeAA | Gibco | 11140-050 | For hepatic progenitor differentiation |
| mTesR 5X Supplement | Stem Cell Technologies | 85852 | For cell culture |
| mTesR Basal Medium | Stem Cell Technologies | 85851 | For cell culture |
| Oncostatin (OSM) | peproTech | 300-10 | For hepatocyte differentiation |
| P450 – CYP3A4 (Luciferin – PFBE) | Promega | V8901 | For CYP450 activity |
| PAS staining kit | Solarbio | G1281 | For PAS staining |
| Pen/Strep | Gibco | 15140-122 | For cell differentiation |
| Peroxidase-Conjugated Goat anti-Mouse IgG | ZSGB-BIO | ZB-2305 | For WB,second antibody |
| Primary Antibody Dilution Buffer for Western Blot | Beyotime | P0256 | For primary antibody dilution |
| ReverTraAce qPCR RT Kit | TOYOBO | FSQ-101 | For cDNA Synthesis |
| RNAiso Plus | TaKaRa | 9109 | For RNA Isolation |
| RPMI 1640 | Gibco | 11875093 | For definitive endoderm formation |
| Skim milk | Sangon Biotech | A600669 | For second antibody preparation |
| SYBR Green Master Mix | Thermo Fisher Scientific | A25742 | For RT-PCR Analysis |
| Torin2 | MCE | HY-13002 | For definitive endoderm formation |
| Tween | Sigma-Aldrich | WXBB7485V | For washing buffer preparation |
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