פריסת AAV של מבני ביטוי מבוססי משפר in vivo במוח עכבר

משפרים הם אלמנטים גנומיים של ויסות ציס-רגולטורי המשמשים כאתרי קשירה של גורמי שעתוק ויכולים להניע את הביטוי של גן מטרה באופן ספציפי מרחבית ^1,2. הם פעילים באופן דיפרנציאלי בסוגי תאים, רקמות ושלבי התפתחות שונים ויכולים להיות מצעים של וריאציה גנומית הקשורה לסיכון למחלות ^3,4. לפיכך, הצורך להבין את הדינמיקה של תפקוד המשפר הוא קריטי להתקדמות הן ביישומים תרגומיים והן ביישומים מדעיים בסיסיים בגנומיקה. בסיליקו תחזיות של פעילות משפר יכולות לשמש משאבים מצוינים ליצירת השערות לגבי יכולת שיפור ^5,6. פעילות משפרת חזויה כזו יכולה לדרוש תיקוף וחקירה נוספים להבנה מלאה של הפעילות התפקודית. מבחני כתבים משפרים הוכיחו את עצמם כבעלי ערך למטרה זו במגוון מערכות, מתאים ועד בעלי חיים ^7,8,9. לקראת הרחבת מחקרים אלה בהקשר גמיש וחסכוני של in vivo, פרוטוקול זה מתאר את השימוש בשיטות מבוססות in vivo AAV לבדיקת רצפי משפר פוטטיביים על יכולתם להניע את הביטוי של גן מדווח חוץ רחמי במוח העכבר שלאחר הלידה. למשפחה זו של שיטות יש תועלת בחקירת רצפי מועמדים בודדים או סינון ספרייה מקביל והיא רלוונטית למחקר בסיסי ותרגומי.

שיטה זו משלבת בפלסמיד יחיד רצף דנ”א מועמד לשיפור פוטטיבי עם גן מדווח (כאן EGFP), תחת שליטתו של מקדם מינימלי שאינו מניע ביטוי משמעותי. הפלסמיד נארז לתוך AAV רקומביננטי (rAAV) ומוזרק למודל של בעלי חיים. בעוד היישום כאן הוא על המוח, סרוטיפים שונים של rAAV מאפשרים זיהום על פני סוגי רקמות שונים, כך שניתן להרחיב גישה זו למערכות אחרות¹⁰. לאחר פרק זמן מסוים, ניתן לאסוף את המוח ולבדוק את הביטוי של הגן המדווח. ביטוי חזק, בהשוואה לבקרות, מצביע על כך שרצף המועמדים שנבדקו הצליח “לשפר” את ביטוי הגן (איור 1). עיצוב פשוט זה מציע גישה קלה וברורה לבדיקת רצף של פעילות משפרת in vivo במוח.

בנוסף לבדיקת יכולת השיפור של רצף, ניתן לשלב שיטה זו עם טכניקות לקביעת פעילות משפר מסוג תא. בגישות מבוססות רצף לקביעת פעילות משפרת דיפרנציאלית, מיון תאים על סמנים ספציפיים לסוג התא לפני ריצוף דנ”א ורנ”א יכול לאפשר לחוקרים לקבוע אם סוגי תאים שונים מראים פעילות משפרת דיפרנציאלית, כפי שתואר ב- Gisselbrecht et ^al.11. בגישות מבוססות הדמיה, תיוג משותף של תמונות עם סמנים ספציפיים לסוג תא מאפשר לבחון אם תאים המציגים פלואורסצנציה מונעת משפר מציגים גם סמנים מסוג תא בעלי עניין 12,13,14,15,16. מבחני כתב משפר מאפשרים בדיקה ישירה של שונות אלילית הקשורה לסיכון במשפרים להשפעות על יכולת המשפר. הרוב המכריע של מוקדי הסיכון שזוהו במחקרי אסוציאציה כלל-גנומית (GWAS) נמצאים באזורים שאינם מקודדים בגנום¹⁷. מחקרי ביאור פונקציונליים של מוקדי סיכון אלה מצביעים על כך שחלק גדול ככל הנראה פועלים כמשפרים^18,19,20. פריסת MPRA in vivo יכולה לאפשר בדיקה של גרסאות אלה הקשורות לסיכון לפעילות משפרת במוח^12,21. לבסוף, משלוח ואיסוף בנקודות זמן שונות יכולים להציע תובנות לגבי השלבים ההתפתחותיים שבמהלכם פעיל המשפר.

עיצובי פלסמידים משפרים-כתבים הם מגוונים וניתן להתאים אותם אישית כך שיתאימו למטרות הניסוי. ישנן מספר אפשרויות עבור מקדמים מינימליים ששימשו במחקר משפר, כגון מקדם מינימלי β-גלובין אנושי²² ועכבר Hsp68 מקדם מינימלי²³. מקדמים אלה ידועים כמניעים רמות נמוכות של ביטוי, אלא אם כן הם משולבים עם אלמנט משפר כדי להפעיל אותם. לעומת זאת, אלמנטים מקדימים מכוננים מניעים ביטוי חזק של הטרנסגן, שימושי לשליטה חיובית או לבדיקת תפקוד משפר על רקע ביטוי חזק. אפשרויות נפוצות עבור מקדמים מכוננים כוללות CAG, מקדם היברידי המופק ממקדם β-אקטין עוף ומשפר ציטומגלווירוס^{מיידי 24}, או EF1α²⁵ אנושי. מאחר שידוע שמשפרים פועלים באופן דו-כיווני²⁶, הכיוון והמיקום של המשפר ביחס למקדם המינימלי הם גמישים (איור 2A). מבחני משפר-כתב מסורתיים ממקמים את המשפר במעלה הזרם של המקדם, ובמשלוחי ספרייה, כוללים רצף ברקוד במורד הזרם של הגן המדווח כדי לשייך קריאות ריצוף עם המשפר^{הנבדק 27}. עם זאת, משפרים יכולים גם להיות ממוקמים במסגרת הקריאה הפתוחה של הגן המדווח ולשמש כרצף ברקוד משלהם, כפי שנעשה ב- STARR-seq²⁸. הפרוטוקול המתואר כאן משתמש בתכנון הבדיקה STARR-seq, ומכניס את רצף משפר המועמדים לתוך 3′ UTR של הגן המדווח. בעוד שהאוריינטציה STARR-seq מציעה את היתרון של שיבוט יעיל יותר, היא פחות מובנת מהגישה הקונבנציונלית ועשויה לגרום ליציבות RNA משתנה בין מבנים. ניתן להתאים בקלות את השיטות המתוארות לכיוון STARR-seq או קונבנציונלי עם שינויים קלים בתהליך השיבוט שתוארו במקום אחר^27,29.

ניתן להשתמש בשיטות שונות של אספקת AAV כדי להתאים אישית עוד יותר את הטכניקה הזו כך שתתאים למטרות הניסוי (איור 2B). זריקות תוך גולגולתיות ישירות, המתוארות בהרחבה בפרוטוקול זה, מספקות ריכוז גבוה של הנגיף ישירות למוח³⁰. זה נותן יעילות התמרה גבוהה המרוכזת באתר ההזרקה, מה שהופך את זה לטכניקה מצוינת לניסויים המבקשים למקסם את הצפיפות של תאים מתמרים על פני אזור של רקמה. הזרקה סטריאוטקטית יכולה לעזור לתקנן את אתר ההזרקה על פני בעלי חיים לצורך התמרה מקומית הניתנת לשחזור. זריקות תוך גולגולתיות הן הפשוטות ביותר בבעלי חיים מוקדמים לאחר הלידה. כטכניקה חלופית, זריקות סיסטמיות יכולות להעביר טרנסגנים באמצעות AAVs עם סרוטיפים המסוגלים לחצות את מחסום הדם-מוח³¹. זריקות לווריד הזנב מאפשרות לנגיף להסתובב בכל הגוף, ומאפשרות העברה כללית על פני רקמות רבות¹⁰. זריקות רטרו-אורביטליות הן טכניקת הזרקה מערכתית נוספת המעבירה את הנגיף מאחורי העין לתוך הסינוס הרטרו-אורביטלי³². זה מציע מסלול ישיר יותר עבור AAV מהמערכת הוורידית למוח, וכתוצאה מכך ריכוז גבוה יותר של תאים מתמרים במוח מאשר זריקות לתוך כלי דם היקפיים יותר³³.

היבט גמיש נוסף של טכניקה זו הוא שיטת הקריאה. באופן כללי, ניתן לתאר אפשרויות כמבוססות דיווח או מבוססות רצף (איור 2C). שילוב כתב פלואורסצנטי כגון GFP במסגרת הקריאה הפתוחה של המבנה מביא לביטוי של החלבון הפלואורסצנטי בכל התאים המתמרים שבהם המשפר המועמד הניע ביטוי. טכניקות תיוג והדמיה כגון אימונוהיסטוכימיה מאפשרות הגברת אותות. טכניקות קריאה מבוססות ריצוף כוללות זיהוי רצפים מהמבנה המועבר ב-RNA שנאסף מהרקמה. על ידי כימות כמות הדנ”א הנגיפי שנמסר בתחילה, ניתן להשתמש בהשוואה של רנ”א מבוטא לעומת דנ”א מועבר כדי לקבוע את המידה שבה רצף משפר שנבדק היה מסוגל להניע ביטוי מוגבר של הטרנסגן, למשל, בהקשר של בדיקת כתב מקבילה מסיבית (MPRA). MPRAs מציעים הרחבה רבת עוצמה של טכניקות אלה כדי לבדוק עד אלפי משפרים מועמדים לפעילות בו זמנית ותוארו בהרחבה במחקר גנומי 12,27,34,35,36. סינון תפוקה גבוה יותר מושג על ידי ביצוע שלבי שיבוט, אריזה, מסירה ורצף עבור משפרי מועמדים באצווה ולא בנפרד.

בחירת משפר מועמדים מספקת הזדמנות נוספת לגמישות (איור 2D). לדוגמה, בדיקה זו יכולה לשמש לזיהוי משפרים של גן מסוים, כדי לוודא את תפקודם של אזורי עניין ב- DNA שאינם מקודדים, או כדי לקבוע סוגי תאים ספציפיים או שלבים התפתחותיים שבמהלכם פעיל משפר – כל אלה משרתים מטרות הן במדע בסיסי והן בחקר מחלות. באופן כללי, בחירת משפר מועמדים מונעת על ידי תחזיות סיליקו של פעילות המשפר. בדרך כלל, תחזיות סיליקו כוללות ChIP-seq עבור שינויים היסטון המצביעים על משפרים אפשריים, כגון H3K27ac³⁷ ומיפוי נגישות כרומטין³⁸. לבסוף, תחום מחקר הולך וגדל הוא סינון מבוסס פונקציה של אלמנטים משפרים שתוכננו באופן סינתטי, המאפשר מחקרים על האופן שבו רצף משפר מכוון את פונקציה³⁹ ותכנון של משפרים עם תכונות ספציפיות⁴⁰.