AAV-Einsatz von Enhancer-basierten Expressionskonstrukten in vivo im Gehirn von Mäusen

Enhancer sind genomische cis-regulatorische Elemente, die als Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen dienen und die Expression eines Zielgens räumlich spezifisch vorantreiben können ^1,2. Sie sind in verschiedenen Zelltypen, Geweben und Entwicklungsstadien unterschiedlich aktiv und können Substrate krankheitsrisikobedingter genomischer Variation sein ^3,4. Daher ist die Notwendigkeit, die Dynamik der Enhancer-Funktion zu verstehen, entscheidend für den Fortschritt sowohl in translationalen als auch in grundlagenwissenschaftlichen Anwendungen innerhalb der Genomik. In-silico-Vorhersagen der Enhancer-Aktivität können als hervorragende Ressourcen für die Erstellung von Hypothesen über die Enhancer-Fähigkeit^{dienen 5,6}. Eine solche vorhergesagte Enhancer-Aktivität kann eine zusätzliche Validierung und Abfrage erfordern, um die funktionelle Aktivität vollständig zu verstehen. Enhancer-Reporter-Assays haben sich für diesen Zweck in einer Vielzahl von Systemen als wertvoll erwiesen, von Zellen bis hin zu Tieren ^7,8,9. Um diese Studien in einem flexiblen und kostengünstigen transienten In-vivo-Kontext zu erweitern, beschreibt dieses Protokoll die Verwendung von in vivo AAV-basierten Methoden, um mutmaßliche Enhancer-Sequenzen auf ihre Fähigkeit zu testen, die Expression eines ektopischen Reportergens im postnatalen Mausgehirn zu steuern. Diese Methodenfamilie eignet sich für die Abfrage einzelner Kandidatensequenzen oder das parallele Bibliotheksscreening und ist für die Grundlagen- und translationale Forschung relevant.

Diese Methode kombiniert in einem einzigen Plasmid eine mutmaßliche Enhancer-Kandidaten-DNA-Sequenz mit einem Reportergen (hier EGFP), unter der Kontrolle eines minimalen Promotors, der allein keine signifikante Expression antreibt. Das Plasmid wird in rekombinante AAV (rAAV) verpackt und in ein Tiermodell injiziert. Während die Anwendung hier auf das Gehirn gerichtet ist, ermöglichen verschiedene rAAV-Serotypen eine Infektion über verschiedene Gewebetypen hinweg, so dass dieser Ansatz auf andere Systeme ausgedehnt werden kann¹⁰. Nach einiger Zeit kann das Gehirn gesammelt und auf die Expression des Reportergens untersucht werden. Die starke Expression im Vergleich zu Kontrollen deutet darauf hin, dass die getestete Kandidatensequenz die Expression des Gens “verstärken” konnte (Abbildung 1). Dieses einfache Design bietet einen einfachen und klaren Ansatz, um eine Sequenz für die Enhancer-Aktivität in vivo im Gehirn zu testen.

Zusätzlich zum Testen der Enhancer-Fähigkeit einer Sequenz kann diese Methode mit Techniken zur Bestimmung der Zelltyp-Enhancer-Aktivität kombiniert werden. In sequenzbasierten Ansätzen zur Bestimmung der differentiellen Enhancer-Aktivität kann die Sortierung von Zellen nach zelltypspezifischen Markern vor der DNA- und RNA-Sequenzierung es Forschern ermöglichen, festzustellen, ob verschiedene Zelltypen differentielle Enhancer-Aktivität zeigen, wie in Gisselbrecht et ^al.11 beschrieben. In bildgebenden Ansätzen ermöglicht die Co-Markierung von Bildern mit zelltypspezifischen Markern die Untersuchung, ob Zellen mit Enhancer-getriebener Fluoreszenz auch Zelltypmarker von Interesse aufweisen 12,13,14,15,16. Enhancer-Reporter-Assays ermöglichen das direkte Testen der risikoassoziierten allelischen Variation von Enhancern auf Auswirkungen auf die Enhancer-Fähigkeit. Die überwiegende Mehrheit der in genomweiten Assoziationsstudien (GWAS) identifizierten Risikoorte liegt in nicht-kodierenden Regionen des Genoms¹⁷. Funktionelle Annotationsstudien dieser Risikoorte deuten darauf hin, dass ein großer Teil wahrscheinlich als Verstärker wirkt^18,19,20. Der MPRA-Einsatz in vivo kann es ermöglichen, diese risikoassoziierten Varianten auf Enhancer-Aktivität im Gehirn^{zu testen 12,21}. Schließlich können Lieferung und Abholung zu unterschiedlichen Zeitpunkten Einblicke in die Entwicklungsphasen geben, in denen ein Enhancer aktiv ist.

Enhancer-Reporter-Plasmid-Designs sind vielfältig und können an experimentelle Ziele angepasst werden. Es gibt mehrere Optionen für minimale Promotoren, die in der Enhancer-Forschung verwendet wurden, wie der humane β-Globin-Minimalpromotor²² und der Maus-Hsp68-Minimalpromotor²³. Es ist bekannt, dass diese Promotoren niedrige Expressionsniveaus antreiben, es sei denn, sie werden mit einem Enhancer-Element gekoppelt, um sie zu aktivieren. Im Gegensatz dazu treiben konstitutive Promotorelemente eine starke Expression des Transgens an, die für die Positivkontrolle oder zum Testen der Enhancer-Funktion vor dem Hintergrund einer robusten Expression nützlich ist. Übliche Optionen für konstitutive Promotoren sind CAG, ein Hybridpromotor, der aus dem Hühner-β-Aktin-Promotor und dem Cytomegalovirus-Immediate-Early Enhancer²⁴ gewonnen wird, oder humanes EF1α²⁵. Da bekannt ist, dass Enhancer bidirektional arbeiten²⁶, sind die Ausrichtung und Position des Enhancers relativ zum minimalen Promotor flexibel (Abbildung 2A). Traditionelle Enhancer-Reporter-Assays platzieren den Enhancer vor dem Promotor und enthalten bei Bibliothekslieferungen eine Barcode-Sequenz stromabwärts des Reportergens, um Sequenzierungslesevorgänge mit dem getesteten Enhancer²⁷ zu verknüpfen. Enhancer können aber auch im offenen Leserahmen des Reportergens platziert werden und als eigene Barcode-Sequenz dienen, wie es in STARR-seq²⁸ der Fall ist. Das hier beschriebene Protokoll verwendet das STARR-seq-Assay-Design, wobei die Kandidaten-Enhancer-Sequenz in die 3′-UTR des Reportergens platziert wird. Während die STARR-seq-Orientierung den Vorteil einer schlankeren Klonierung bietet, ist sie weniger gut verstanden als der herkömmliche Ansatz und kann eine variable RNA-Stabilität zwischen Konstrukten induzieren. Die beschriebenen Methoden können leicht entweder an die STARR-seq oder die konventionelle Orientierung angepasst werden, mit geringfügigen Änderungen des Klonierungsprozesses, die an anderer Stelle^27,29 beschrieben wurden.

Verschiedene Methoden der AAV-Verabreichung können verwendet werden, um diese Technik weiter an experimentelle Ziele anzupassen (Abbildung 2B). Direkte intrakranielle Injektionen, die in diesem Protokoll näher beschrieben werden, liefern eine hohe Viruskonzentration direkt an das Gehirn³⁰. Dies ergibt eine hohe Transduktionseffizienz, die sich auf die Injektionsstelle konzentriert, was dies zu einer ausgezeichneten Technik für Experimente macht, die die Dichte transduzierter Zellen über einen Gewebebereich maximieren wollen. Stereotaktische Injektion kann dazu beitragen, die Injektionsstelle über Tiere hinweg zu standardisieren, um eine reproduzierbare lokalisierte Transduktion zu ermöglichen. Intrakranielle Injektionen sind bei frühen postnatalen Tieren am einfachsten. Als alternative Technik können systemische Injektionen Transgene unter Verwendung von AAVs mit Serotypen liefern, die in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke^{zu überwinden 31}. Schwanzveneninjektionen ermöglichen es dem Virus, im ganzen Körper zu zirkulieren, was eine generalisierte Abgabe über viele Gewebe hinweg ermöglicht¹⁰. Retroorbitale Injektionen sind eine weitere systemische Injektionstechnik, die das Virus hinter dem Auge in den retroorbitalen Sinus³² liefert. Dies bietet einen direkteren Weg für das AAV vom Venensystem zum Gehirn, was zu einer höheren Konzentration von transduzierten Zellen im Gehirn führt als Injektionen in peripherere Blutgefäße³³.

Ein weiterer flexibler Aspekt dieser Technik ist die Methode des Auslesens. Im Großen und Ganzen können Optionen als reporterbasiert oder sequenzierungsbasiert beschrieben werden (Abbildung 2C). Die Integration eines fluoreszierenden Reporters wie GFP in den offenen Leserahmen des Konstrukts führt zur Expression des fluoreszierenden Proteins in allen transduzierten Zellen, in denen der Kandidatenverstärker die Expression antreibt. Markierungs- und Bildgebungsverfahren wie die Immunhistochemie ermöglichen die Signalverstärkung. Sequenzierungsbasierte Auslesetechniken beinhalten die Identifizierung von Sequenzen aus dem gelieferten Konstrukt in RNA, die aus dem Gewebe gesammelt wurde. Durch die Quantifizierung der Menge an viraler DNA, die ursprünglich abgegeben wurde, kann der Vergleich der exprimierten RNA mit der gelieferten DNA verwendet werden, um zu bestimmen, inwieweit eine getestete Enhancer-Sequenz in der Lage war, eine erhöhte Expression des Transgens zu bewirken, beispielsweise im Rahmen eines massively parallel reporter assay (MPRA). MPRAs bieten eine leistungsstarke Erweiterung dieser Techniken, um bis zu Tausende von Kandidaten-Enhancern gleichzeitig auf Aktivität zu testen und wurden in der Genomforschung^ausführlich beschrieben 12,27,34,35,36. Ein höheres Durchsatz-Screening wird durch die Ausführung von Klonierungs-, Verpackungs-, Liefer- und Sequenzierungsschritten für Kandidatenverstärker im Batch und nicht einzeln erreicht.

Die Auswahl von Kandidatenverstärkern bietet eine weitere Möglichkeit zur Flexibilität (Abbildung 2D). Mit diesem Assay können beispielsweise Enhancer eines bestimmten Gens identifiziert, die Funktion nicht-kodierender DNA-Regionen von Interesse ermittelt oder bestimmte Zelltypen oder Entwicklungsstadien bestimmt werden, in denen ein Enhancer aktiv ist – all dies dient Zielen sowohl in der Grundlagenforschung als auch in der Krankheitsforschung. Im Allgemeinen wird die Auswahl von Kandidatenverstärkern durch In-silico-Vorhersagen der Enhancer-Aktivität bestimmt. Im Allgemeinen beinhalten In-silico-Vorhersagen ChIP-seq für Histonmodifikationen, die auf wahrscheinliche Enhancer hinweisen, wie H3K27ac³⁷ und Chromatin-Zugänglichkeitskartierung³⁸. Schließlich ist ein wachsendes Forschungsgebiet das funktionsbasierte Screening synthetisch gestalteter Enhancer-Elemente, das Studien darüber ermöglicht, wie die Enhancer-Sequenz die Funktion³⁹ steuert, und das Design von Enhancern mit spezifischen Eigenschaften⁴⁰.