基于增强子的表达构建体在小鼠 大脑中的 AAV部署

增强子是作为转录因子结合位点的基因组顺式调控元件，可以以时空特异性的方式驱动靶基因的表达^1，2。它们在不同的细胞类型、组织和发育阶段中具有差异活性，并且可以是疾病风险相关基因组变异的底物^3，4。因此，了解增强子功能动态的需求对于基因组学中转化和基础科学应用的进展至关重要。在计算机中，增强子活性的预测可以作为产生^{增强子能力}假设的极好资源5^，6。这种预测的增强子活性可能需要额外的验证和询问，以充分了解功能活性。增强子报告基因测定已被证明在从细胞到动物的各种系统中具有此目的的价值⁷，^8，9。为了在灵活且具有成本效益的瞬时体内环境中扩展这些研究，该协议描述了使用基于体内AAV的方法来测试推定的增强子序列，以了解它们在出生后小鼠大脑中驱动异位报告基因表达的能力。这一系列方法可用于询问单个候选序列或平行文库筛选，并且与基础和转化研究相关。

该方法在单个质粒中将推定的增强子候选DNA序列与报告基因（此处为EGFP）结合，在最小启动子的控制下，单独不驱动显着表达。将质粒包装成重组AAV（rAAV）并注射到动物模型中。虽然这里的应用是大脑，但各种rAAV血清型能够感染不同的组织类型，因此这种方法可以扩展到其他系统¹⁰。一段时间后，可以收集大脑并检测报告基因的表达。与对照组相比，强表达表明测试的候选序列能够“增强”基因的表达（图1）。这种简单的设计提供了一种简单明了的方法来测试 大脑中体内 增强子活性的序列。

除了测试序列的增强子能力外，该方法还可以与确定细胞类型增强子活性的技术相结合。在确定差异增强子活性的基于序列的方法中，在DNA和RNA测序之前对细胞类型特异性标记进行分选可以使研究人员确定不同的细胞类型是否显示出差异增强子活性，如Gisselbrecht等人¹¹所述。在基于成像的方法中，将图像与细胞类型特异性标记物共标记，可以检查表现出增强子驱动荧光的细胞是否也显示感兴趣的细胞类型标记^物12，¹³，^14，15，16。增强子报告基因测定能够直接测试增强子中与风险相关的等位基因变异对增强子能力的影响。在全基因组关联研究（GWAS）中确定的绝大多数风险位点位于基因组的非编码区域¹⁷。这些风险位点的功能注释研究表明，很大一部分可能充当增强子¹⁸，^19，20。MPRA在体内部署可以测试这些与风险相关的变异，以增强大脑^{中的活性12，21}。最后，不同时间点的交付和收集可以提供对增强子活跃的发育阶段的见解。

增强子-报告质粒设计多种多样，可以定制以适应实验目标。有几种用于增强子研究的最小启动子的选择，例如人β珠蛋白最小启动子²² 和小鼠Hsp68最小启动子²³。已知这些启动子会驱动低水平的表达，除非与增强子元件耦合来激活它们。相反，组成型启动子元件驱动转基因的强表达，可用于阳性对照或在稳健表达的背景下测试增强子功能。组成型启动子的常见选择包括CAG，一种衍生自鸡β-肌动蛋白启动子和巨细胞病毒即时早期增强子24的杂交启动子²⁴，或人EF1α²⁵。由于已知增强子²⁶双向工作，因此增强子相对于最小启动子的方向和位置是灵活的（图2A）。传统的增强子-报告基因测定将增强子置于启动子的上游，并且在文库递送中，包括报告基因下游的条形码序列，以将测序读数与测试的增强子²⁷相关联。然而，增强子也可以放置在报告基因的开放阅读框架中，并作为它们自己的条形码序列，就像在STARR-seq²⁸中所做的那样。这里描述的方案利用STARR-seq测定设计，将候选增强子序列放入报告基因的3′ UTR中。虽然STARR-seq取向提供了更简化的克隆的好处，但与传统方法相比，它不太清楚，并且可能在构建体之间诱导可变的RNA稳定性。所描述的方法可以很容易地适应STARR-seq或常规取向，对克隆过程进行微小的改变，这些改动已在其他地方描述^27，29。

可以采用不同的AAV递送方法来进一步定制该技术以适应实验目标（图2B）。直接颅内注射，在本协议中进一步描述，将高浓度的病毒直接输送到大脑³⁰。这提供了以注射部位为中心的高转导效率，使其成为希望最大化组织区域内转导细胞密度的实验的绝佳技术。立体定向注射可以帮助标准化动物的注射部位，以实现可重复的局部转导。颅内注射在出生后早期动物中最直接。作为一种替代技术，全身注射可以使用具有能够穿过血脑屏障的血清型的AAV传递转基因³¹。尾静脉注射允许病毒在全身循环，从而可以在许多组织中广泛传递¹⁰。眶后注射是另一种全身注射技术，可将病毒从眼睛后面输送到眶后窦³²。这为AAV从静脉系统到大脑提供了更直接的途径，导致大脑中转导细胞的浓度高于注射到更多外周血管中的浓度³³。

这种技术的另一个灵活方面是读出方法。从广义上讲，选项可以描述为基于报告基因或基于测序（图2C）。将荧光报告基因（如GFP）掺入构建体的开放阅读框中，导致荧光蛋白在候选增强子驱动表达的任何转导细胞中的表达。标记和成像技术（如免疫组织化学）可实现信号放大。基于测序的读出技术涉及从组织收集的RNA中从递送的构建体中识别序列。通过量化最初递送的病毒DNA的数量，表达RNA与递送DNA的比较可用于确定测试的增强子序列能够在多大程度上驱动转基因的表达增加，例如，在大规模平行报告测定（MPRA）的背景下。MPRA提供了这些技术的强大扩展，可以同时测试多达数千种候选增强子的活性，并在基因组学研究中进行了广泛的描述¹²，²⁷，^34，35，36。通过批量而不是单独对候选增强子执行克隆、包装、递送和测序步骤，可以实现更高的通量筛选。

候选增强子选择提供了另一个灵活性的机会（图 2D）。例如，该测定可用于鉴定特定基因的增强子，确定感兴趣的非编码DNA区域的功能，或确定增强子活跃的特定细胞类型或发育阶段 – 所有这些都服务于基础科学和疾病研究的目标。通常，候选增强子 的选择是由增强 子活性的计算机预测驱动的。通常， 计算机 预测包括组蛋白修饰的 ChIP-seq，这些修饰指示可能的增强子，例如 H3K27ac³⁷ 和染色质可及性映射³⁸。最后，一个不断增长的研究领域是对合成设计的增强子元件进行基于功能的筛选，从而能够研究增强子序列如何指导功能³⁹ 和设计具有特定性质的增强子⁴⁰。