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신경과학

깨어있는 마우스 에서 반복되는 생체 내 이미징을위한 두개골 창 이식

Published: June 22, 2021
doi:
10.3791/62633
, ,
1Department of Neurological Sciences,University of Nebraska Medical Center

Summary

여기에 제시된 것은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을위한 만성 두개골 창을 이식하기위한 프로토콜입니다.

Abstract

행동하는 동물에서 뉴런과 글리아교의 세포 생리학을 완전히 이해하려면 행동 마우스에서 형태를 시각화하고 생체 내에서 활동을 기록해야합니다. 이 논문은 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 뇌 세포의 종방향 이미징을 허용하기 위해 만성 두개골 창을 이식하는 방법을 설명합니다. 유전자 전략 및 바이러스 주사와 조합하여, 특정 세포 및 관심 영역을 구조적 또는 생리학적 마커로 표지할 수 있다. 이 프로토콜은 두개골 창을 통해 두 세포를 동시에 이미징하기 위해 피질에서 GCaMP6 발현 성상 세포 근처의 뉴런을 표지하기 위해 바이러스 주사를 결합하는 방법을 보여줍니다. 동일한 세포의 다중 광자 이미징은 깨어 있고 행동하는 동물에서 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 수행 될 수 있습니다. 이 접근법은 연구자들에게 실시간으로 세포 역학을 보는 방법을 제공하며 신경 과학의 여러 가지 질문에 답하기 위해 적용될 수 있습니다.

Introduction

마우스의 피질에서 생체 내 다광자 형광 현미경을 수행하는 능력은 세포 신호 전달 및 구조 1,2,3,4,5,6,7,8,9, 질병 병리학 10,11 및 세포 발달 12,13에 대한 연구에 가장 중요합니다. . 만성 두개골 창문을 이식하면 종방향 이미징이 가능하여 살아있는 동물에서 며칠, 몇 주 또는 몇 달 동안 피질 부위를 반복적으로 이미징 할 수 있습니다13,14. 다중 광자 현미경 검사는 적외선 레이저와 관련된 향상된 깊이 프로빙 및 감소 된 광손상으로 인해 생체 내에서 반복적 인 이미징에 이상적입니다. 이것은 다양한 피질 영역에서 특정 세포의 분자 및 세포 역학에 대한 연구를 가능하게합니다.

다중 광자 현미경 검사는 마우스 15,16,17,18,19,20에서 신경 및 신경교 세포의 생체 내 영상화에 사용되어 왔다. 특정 세포 유형 및 관심 영역을 라벨링하기 위해 다양한 전략이 구현될 수 있다. 하나의 일반적인 접근법은 Cre-Lox 재조합 시스템을 사용하여 세포 특이적 방식으로 유전적으로 코딩된 형광 단백질의 발현을 유도하는 것이다. 이는 유전적으로 변형된 마우스, 예를 들어, 관심있는 프로모터 21 하에 Cre-recombinase를 발현하는 마우스와 tdTomato “floxed” 마우스 (Ai14)를 교차시킴으로써 수행될 수 있다. 대안적으로, 세포- 및 부위-특이적 표지는 바이러스 주사로 달성될 수 있다. 여기서, Cre 재조합효소를 코딩하는 바이러스는 세포 특이적 프로모터 및 관심의 플록스 유전자를 코딩하는 바이러스 하에 정의된 영역에 주입된다. 두 바이러스 벡터 모두를 수용하는 적절한 세포 유형은 이어서 원하는 유전자(들)를 발현할 것이다. 이들 유전자는 tdTomato와 같은 구조적 마커로서 세포 형태학(22)의 변화를 보기 위해, 칼슘 역학(23)을 검사하기 위해 GCaMP 및/또는 RCaMP와 같은 유전적으로 암호화된 칼슘 지표(GECIs)일 수 있다. 유전적 재조합의 방법은 하나 이상의 세포 유형을 표지하기 위해 개별적으로 또는 조합하여 적용될 수 있다. 트랜스제닉 마우스 또는 바이러스 구축물(제한된 패키징 용량을 갖는)을 필요로 하지 않는 세 번째 접근법은 DNA 구축물(24)의 utero 전기천공에 있다. 전기천공의 타이밍에 따라, 상이한 셀 타입들이 표적화될 수 있다(25,26,27).

다중 광자 이미징을 수행 할 때, 마우스는 깨어 있거나 마취되는 동안 이미징 될 수 있습니다. 깨어 있는 마우스의 이미징은 부착된 헤드 플레이트(28)를 통해 마우스를 고정시킴으로써 수행될 수 있다. 이러한 접근법은 자유 부유, 공기 지지형 스티로폼 볼(29), 자유 유동 러닝머신(1), 또는 마우스가 부착된 헤드 플레이트에 의해 고정되고 개방된 챔버(30)에서 이동하도록 허용하는 공랭식 홈 케이지 시스템과 같은 방법을 사용하여 동물의 비교적 자유로운 이동을 허용함으로써 스트레스를 덜 받는다. 이러한 각각의 이미징 조건에 대해, 먼저 이미징 셋업에 마우스를 습관화하는 것이 필요할 것이다. 이 백서에서는 공수 홈 케이지 시스템을 사용한 습관화 및 이미징 절차에 대해 설명합니다.

이 프로토콜은 피질에서 종방향 생체내 영상화를 위한 만성 두개골 창의 이식을 기술한다. 여기에서는 성상세포에서 GCaMP6f를 조건부로 발현하는 마우스를 사용하여 칼슘 신호 역학을 모니터링합니다. 또한,이 논문은 tdTomato를 뉴런의 라벨로 사용하는 바이러스 주사 절차를 설명합니다. 이것은 뉴런 시냅스 구조의 변화 및/또는 동일한 성상세포의 반복적인 이미징을 가능하게 하는 구조적 마커로서의 유용성을 결정할 수 있게 한다. 프로토콜 전반에 걸쳐 다중 광자 현미경에서 얻은 최상의 이미지 품질을 보장하기 위해 중요한 단계가 강조 표시됩니다.

Protocol

모든 동물 실험은 네브래스카 대학 의료 센터에서 IACUC가 승인 한 지침에 따라 수행되었습니다. 1. 수술 전 바이러스 주사를위한 피펫을 준비하십시오. 피펫 풀러를 사용하여 붕규산염 유리 모세혈관을 당기고 피펫을 20° 각도로 비스듬히 기울입니다. 피펫을 밤새 살균하십시오. 멸균 젤 폼의 신선한 조각을 작은 사각형으로 절단하여 준비하십시오. 겔 폼을 0.5 m…

Representative Results

두개골 창의 품질은 신경 구조가 얼마나 선명하게 나타나는지에 따라 평가 될 수 있습니다. 좋은 창문에서는 수지상 척추가 명확하게 보입니다 (그림 1). 저장된 구조 및 위치 데이터를 사용하면 동일한 동물을 수일, 몇 주 또는 몇 달 동안 반복적으로 이미지화하여 동일한 세포를 검사할 수 있습니다(그림 1). 도 1 의 이미지는 일?…

Discussion

여기에서, 우리는 공중 들어 올린 홈 케이지에 깨어 있고 머리가 억제 된 마우스에서 피질 성상 세포 및 뉴런의 생체 내 이미징을위한 만성 두개골 창문을 이식하기위한 프로토콜을 제시했습니다. 구체적인 예가 GECIs 및 뉴런 시냅스 구조를 발현하는 성상세포를 영상화하기 위한 두개골 창 응용의 제공되었다. 다중 광자 현미경을 사용하면 천체 칼슘 신호 역학 및 구조적 시냅스 역학을 며?…

Materials

15o Pointed Blade Surgistar 6500 Surgery Tools
19 G Needles BD 305186 Surgery Supply
AAV1-CAG-FLEX-tdTomato Addgene 28306-AAV1 Viral Vector
AAV1-CaMKII-0-4-Cre Addgene 105558-AAV1 Viral Vector
Acteone Fisher Scientific A16P4 Reagent
Alcohol Prep Pads Fisher Scientific Covidien 5750 Surgery Supply
Beveler Narishige Equipment
Borosilicate Glass World Precision Instruments TW100F-4 Surgery Supply
Carbide Burs SS White Dental 14717 Surgery Tools
Carprofen (Rimadyl), 50 mg/mL Zoetis Mylan Institutional, LLC. Drug
Compressed Air Fisher Scientific 23-022-523 Surgery Supply
Cotton Tip Applicators Puritan 836-WC NO BINDER Surgery Supply
Cover Glass, No. 1 thickness, 3 mm/5 mm Warner Instruments 64-0720, 64-0700 Surgery Supply
Dental Drill Aseptico Equipment
Dexamethasone, 4 mg/mL Mylan Institutional, LLC. Drug
Dissecting Microscope Nikon Equipment
Duralay Liquid  (dental cement liquid) Patterson Dental 602-8518 Reagent
Duralay Powder  (dental cement powder) Patterson Dental 602-7932 Reagent
Enrofloxacin, 2.27% Bayer Drug
Eye Ointment Dechra 17033-211-38 Surgery Supply
Fiber Lite High Intensity Illuminator Dolan-Jenner Industries Equipment
Forceps (Large) World Precision Instruments 14099 Surgery Tools
Forceps (Small) World Precision Instruments 501764 Surgery Tools
GCaMP6f B6; 129S-Gt(ROSA)26Sortm95.1(CAGGCaMP6f)Hze/J The Jackson Laboratory Stock No: 024105 Mouse line
Germinator Fisher Scientific Equipment
GLAST-CreER Tg(Slc1a3-cre/ERT) 1Nat/J The Jackson Laboratory Stock No: 012586 Mouse Line
Headplate Neurotar Model 1, Model 3 Surgery Supply
Hemostatic forceps World Precision Instruments 501705 Surgery Tools
Holder for 15o Pointed Blade World Precision Instruments 501247 Surgery Tools
Holder for Scalpel Blades World Precision Instruments 500236 Surgery Tools
Iodine Prep Pads Avantor 15648-926 Surgery Supply
Isoflurane Piramal Surgery Supply
Isoflurane table top system with Induction Box Harvard Apparatus Equipment
Isoflurane Vaporizer SurgiVet Equipment
Krazy Glue Office Depot KG517 Reagent
Loctite 401 Henkel 40140 fast-curing instant adhesive
Loctite 454 Fisher Scientific NC9194415 cyanoacrylate adhesive gel
Micropipette Puller Sutter Instruments Equipment
Multiphoton Microscope Equipment
Nitrogen Matheson NI M200 Gas
Oxygen Matheson OX M250 Gas
Picospritzer Parker intracellular microinjection dispense system
Pipette Tips Rainin 17014340 Surgery Supply
Rodent Hair Trimmer Wahl Equipment
Saline (0.9% Sodium Chloride) Med Vet International RX0.9NACL-30BAC Surgery Supply
Scalpel Blades, Size 11 Integra 4-111 Surgery Tools
Scissors World Precision Instruments 503667 Surgery Tools
Stereotaxic Instrument Stoelting Equipment
Sugi Sponge Strips (sponge strips) Kettenbach Dental 31002 Surgery Supply
SURGIFOAM (gel foam) Ethicon 1972 Surgery Supply
Syringe with 26 G Needle BD 309625 Surgery Supply
Tamoxifen Sigma Aldrich T5648-1G Reagent
Ti:Sapphire Laser Coherent Equipment
Transfer Pipettes Fisher Scientific 13-711-9AM Surgery Supply
Water Blanket Fisher Scientific Equipment
Xylocaine MPF with Epinephrine (1:200,000), 10 mg/mL Fresenius Kabi USA Drug
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References

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Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a Cranial Window for Repeated In Vivo Imaging in Awake Mice. J. Vis. Exp. (172), e62633, doi:10.3791/62633 (2021).
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