JoVE Journal > Cancer Research
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
암 연구학

שיטת ניקוד מיקרוסקופית אוטומטית לבדיקת מוקדי γ-H2AX בלימפוציטים אנושיים היקפיים

Published: December 25, 2021
doi:
10.3791/62623
, , , , , , , , , , ,
1Radiation Biophysics Division, Nuclear Medicine Department,iThemba LABS, 2Department of Biotechnology,University of the Western Cape, 3Department of Medical Biosciences,University of the Western Cape, 4Division of Medical Physiology, Department of Medicine and Health Sciences,Stellenbosch University, 5Biodosimetry Service, Instituto de Investigaciones Biológicas Clemente Estable and Academic Unit on Radiation Protection, Faculty of Medicine,University of the Republic, 6MetaSystems Hard & Software GmbH

Summary

פרוטוקול זה מציג את הכנת השקופית ואת הניקוד האוטומטי של γ-H2AX foci בדיקה על לימפוציטים דם היקפיים. כדי להמחיש את השיטה והרגישות של ההסתה, לימפוציטים מבודדים היו מוקרן במבחנה. שיטה אוטומטית זו של זיהוי DNA DSB שימושית עבור יישומי dosimetry ביולוגיים מהירים ותפוקה גבוהה.

Abstract

קרינה מייננת היא גורם רב עוצמה לנזק לדנ”א ומסרטן מתועד היטב. dosimetry ביולוגית כוללת גילוי של השפעות ביולוגיות הנגרמות על ידי חשיפה לקרינה מייננת כדי לבצע הערכת מינון בודדת. הדבר רלוונטי במסגרת מקרי חירום קרינתיים, שבהם הערכות בריאות ותכנון טיפול קליני לנפגעים חשופים הם קריטיים. מאז שברי גדיל כפול DNA (DSB) נחשבים הצורה הקטלנית ביותר של נזק DNA הנגרמת על ידי קרינה, פרוטוקול זה מציג שיטה לזהות DNA DSB בדגימות דם. המתודולוגיה מבוססת על זיהוי של חלבון תיקון DNA זרחן פלואורסצנטי, כלומר, γ-H2AX. השימוש בפלטפורמת מיקרוסקופיה אוטומטית כדי להבקיע את מספר מוקדי γ-H2AX לתא מאפשר ניתוח סטנדרטי עם ירידה משמעותית בזמן המפנה. לכן, לבדיקת γ-H2AX יש פוטנציאל להיות אחת מההצקות המהירות והרגישות ביותר לדוסימטריה ביולוגית. בפרוטוקול זה, דגימות דם שלמות ממתנדבים בוגרים בריאים יעובדו ויוקרן במבחנה על מנת להמחיש את השימוש ב- γ-H2AX מוקדי בדיקה אוטומטיים ורגישים ליישומי ביו-דאודומטריה. מערכת סריקת שקופיות אוטומטית ופלטפורמת ניתוח עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי משולב משמשת, המאפשרת ניקוד מהיר ואוטומטי של DNA DSB עם רמה מופחתת של הטיה.

Introduction

מאז גילויה, קרינה מייננת (IR) הפכה לכלי הכרחי בפרקטיקות הרפואיות והתעשייתיות הנוכחיות, כמו גם ביישומים חקלאיים וצבאיים. עם זאת, השימוש הנרחב ב- IR גם מגביר את הסיכון לחשיפת יתר של קרינה הן עבור עובדי קרינה מקצועיים והן עבור חברי הציבור. IR הוא מסרטן פיזי ידוע שיכול לגרום נזק לדנ”א באופן ישיר או עקיף, מה שמוביל לסיכונים בריאותיים משמעותיים 1,2. לכן, חשוב לבצע הערכת מינון, שכן מידת החשיפה מהווה צעד ראשוני חשוב בניהול תאונת הקרינה 1.

במקרה של מקרי חירום גרעיניים או רדיולוגיים בקנה מידה גדול, מספר הערכות המינון שצריכות להתבצע יכול לנוע בין כמה לאלפי אנשים בהתאם לגודל התאונה3. בתרחישים אלה, dosimetry פיזי עשוי גם להיות מעורפל (למשל, אם dosimeter אינו משוחק כראוי) או לא זמין, כאשר חברי הציבור מעורבים. בעוד תסמינים קליניים יכולים לשמש מיון, הם לא בהכרח ספציפיים לקרינה ויכולים לגרום לאבחון כוזב. לכן, מומלץ להשתמש dosimetry ביולוגי לצד dosimetry פיזי והערכות קליניות. שיטה זו מאפשרת ניתוח של שינויים הנגרמים מקרינה ברמה התאית ומאפשרת זיהוי חד משמעי של אנשים חשופים הזקוקים לטיפול רפואי4. לאחר מכן הרופא יכול להשתמש בהערכת מינון ביולוגי זו כדי להשלים שחזורי מינון פיזיים ואבחנות קליניות אחרות, על מנת לרשום את הטיפול הרפואי המתאים5. הצורך בדוזימטריה ביולוגית יהיה גבוה במיוחד עבור מיון וניהול רפואי של נפגעים כאשר תרחיש החשיפה אינו ידוע וכאשר הקורבנות הם אנשי ציבור. המטרה העיקרית של מיון היא להבחין ביעילות אנשים “מודאגים היטב”, שיכולים להיות סימפטומים פרודרומליים אבל לא קיבלו מינון גבוה, מאנשים חשופים הזקוקים לעזרה רפואית מיידית וטיפול מיוחד. רמת הסף של מינון קרינה שיכולה לגרום למחלת קרינה היא בערך 0.75 – 1.00 Gy. לאחר מכן, אותם אנשים המקבלים > 2 Gy של חשיפה נמצאים בסיכון גבוה יותר לתסמונת קרינה חריפה וצריכים לקבל טיפול רפואי מהיר6,7. הערכות מינון ביולוגיות בזמן ומדויק לקורבנות שנקלעו לאש הצולבת של אסונות כאלה הן קריטיות. בנוסף, זה יכול גם לנחם ולהרגיע קורבנות חשופים מינימלית8.

רשויות הגנת הקרינה משתמשות בסמני ביו-דומימטריה שונים, המבוססים בעיקר על גילוי נזק ציטוגנטי, כגון כרומוזומים דיצנטריים או מיקרונוקלאי, בלימפוציטים אנושיים מתורבתים9. גילוי של נזק ציטוגנטי יכול להתבצע גם על ידי הפלואורסצנטי בהכלאה במקום (FISH) translocation assay10. עם זאת, החיסרון העיקרי של השיטות הציטוגנטיות הקונבנציונליות הוא זמן התפנית הארוך כדי להשיג את התוצאות במצב חירום8.

אחד השלבים המוקדמים ביותר בתהליך זיהוי DSB DNA הוא זרחן של וריאנט histone H2AX, המוביל להיווצרות של γ-H2AX, ואת הגיוס הבא של גורמי תיקון. בעשור האחרון, גילוי של מוקדי γ-H2AX הנגרמים מקרינה בלימפוציטים דם היקפיים באמצעות מיקרוסקופיה אימונופלואורסצנטית קיבל תשומת לב גוברת ככלי דוזימטריה ביולוגיאמין 11,12,13,14,15. בהתאם לאיכות הקרינה וסוג התא, התשואה המרבית של מוקדי γ-H2AX מזוהה בתוך 0.5 – 1 שעה לאחר הקרנה16,17. הוא צפוי כי יש קשר הדוק בין מספר DNA DSB ו γ-H2AX מוקדים, כמו גם בין היעלמות של מוקדים ותיקון DSB. ניסויי מספריים בלייזר עם חיידק לייזר פעמו הוכיחו כי מוקדי γ-H2AX לוקליזציה לאתרים של DNA DSB18. למרות שזה נשאר נושא לדיון פעיל, אחד המחקרים המוקדמים ביותר עם 125הצעתי מתאם אחד על אחד בין המספר המחושב של התפוררות לתא (המייצג את מספר ה- DNA DSB המושרה בקרינה) לבין מספר מוקדי γ-H2AX שהשיגציון 19,20.

בעשור האחרון מימן האיחוד האירופי את הפרויקטים MULTIBIODOSE (כלים ביודוסימטריים רב-תחומיים לניהול נפגעים רדיולוגיים בקנה מידה גבוה) ואת RENEB (מימוש הרשת האירופית לביודו-מדביר) ליצירת רשת בת קיימא בדוסימטריה ביולוגית ורטרוספקטיבית21,22. פרויקט זה כלל מעבדות שונות ברחבי אירופה להערכת יכולות המענה לשעת חירום במקרה חירום רדיולוגי14,21,22. γ-H2AX מוקדי assay יש מספר יתרונות ניכרים, כגון זמן עיבוד מהיר, הפוטנציאל לעיבוד אצווה המאפשר תפוקה גבוהה, כמו גם הרגישות הגבוהה שלה אם נעשה שימוש בתוך כמה שעות לאחר החשיפה13,23,24. הרגישות הגבוהה של הבדיקה בטווח המינון הנמוך הביאה למספר מחקרים שבהם נעשה שימוש בבחינת המוקדים γ-H2AX כאינדיקטור להשפעת החשיפה לקרינה רפואית, הן בהקרנות והן ביישומי הדמיה אבחנתית25,26,27,28,29,30. מאפיינים אלה הופכים את מוקדי γ-H2AX לאלטרנטיבה תחרותית ביותר לשיטות אחרות למיון מוקדם בתאונות גרעיניות גדולות כדי להפריד בין אלה שנחשפו באופן קריטי לאנשים בסיכון נמוך. מספר ניסויי אופטימיזציה המחישו כי זה אפשרי לבצע את γ-H2AX foci assay עם כמויות קטנות של דם, כגון המחקר של Moquet ואח ‘שדיווח כי זה אפשרי לבצע את γ-H2AX foci assay עם רק טיפת דם (דקירת אצבע)31. גישה דומה שימשה בפיתוח מערכת RABIT (כלי ביודוסמטריה אוטומטית מהירה) אוטומטית לחלוטין אשר עברה אופטימיזציה למדידת תשואות γ-H2AX מדגימות דם שמקורן באצבעות אצבע32,33. בסך הכל, התוצאות של מחקרי MULTIBIODOSE ו- RENEB בין השוואה מצביעים על כך שבדיוח המוקדים γ-H2AX יכול להיות כלי מיון שימושי מאוד בעקבות חשיפה לקרינה חריפה (עד 24 שעות)12,13,14. במחקר בין-השוואה לטווח במינון נמוך, ניתן להבחין במינון נמוך עד 10 מ”ג ג’י לבין דגימות בקרה מוקרן מזויף, המדגיש את הרגישות של הבחינה בטווח המינון הנמוך34. חשוב לציין כי הרגישות הגבוהה של הבחינה נכונה במיוחד עבור לימפוציטים, מה שהופך אותם לאחד מסוגי התאים המתאימים ביותר להערכת חשיפות במינון נמוך. לימפוציטים הם בעיקר תאים שאינם רוכבי אופניים ומייצגים אוכלוסייה סינכרונית. האחרון נמנע ביטוי של γ-H2AX קשורה לשכפול DNA, אשר מפחית באופן משמעותי את הרגישות של ה- assay לזהות DSB המושרה קרינה במהלך G2 ו- S-שלב של מחזור התא35. בנוסף לרגישות שלה למינונים נמוכים עבור לימפוציטים, זמן התפנית של בדיקת המוקדים γ-H2AX הוא מהיר משמעותית מאשר טכניקות ציטוגנטיות כגון בדיקת דיצנטרי מיקרונוקלאוס, שכן זה לא דורש גירוי של לימפוציטים. לכן, ניתן להשיג תוצאות בתוך כמה שעות לעומת כמה ימים לטכניקות ציטוגנטיות. חיסרון מרכזי של בדיקת ההיעלמות המהירה של אות המוקדים γ-H2AX, שבדרך כלל יופחת לרמות הבסיס בתוך ימים לאחר החשיפה לקרינה בהתאם לקינטיקה לתיקון הדנ”א36. לכן, היישום המתאים ביותר של הבדיקה בהקשר ביודוסמטריה הוא למטרות מיון ראשוניות ולתעדף יותר זמן ציטוגנטי דוזימטריה ביולוגית מעקב עבור קורבנות מסוימים. עם זאת, עבור ביו-דאודומטריה מדויקת ואפקטים ארוכי טווח, יש להסתמך על טכניקות ציטוגנטיות כגון ניתוחי FISH בשלושה צבעים לגילוי סטיות כרומוזומליות יציבות במקרה שהחשיפה התרחשה לפני מספר שנים10.

כחלק ממספר יוזמות ביו-דוסיאמטריות, נבדקו מספר מבחנים למטרות מיון ליד γ-H2AX כדי להיפטר מאנשים במצבי חירום רדיולוגיים רחבי היקף; כגון בדיקת המיקרונוקלוס של בלוק ציטוקינזיס, תהודה פרמגנטית אלקטרונית (EPR), בדיקת חלבון בסרום (SPA), בדיקת כתמי עור (SSA), זוהר מגורה אופטית (OSL), כמו גם ניתוח ביטוי גנים 37,38. γ-H2AX מוקדי assci ניתן להשתמש כמותית להערכה של היווצרות DNA DSB ותיקון39. עם זאת, ההסתה תלויה בזמן מכיוון שרמת מוקדי γ-H2AX משתנה עם הזמן לאחר ההקרנה עקב תיקון ה- DNA DSB קינטיקה40. מחקר השוואתי המחיש כי ניקוד מיקרוסקופי עם קיבולת z-שלב מציע את התוצאות המדויקות ביותר לאחר 1 Gy של הקרנה, בעוד cytometry זרימה רק נותן תוצאות אמינות במינונים גבוהים יותר של IR41. ישנם דיווחים רבים על פיתוח פתרונות ניתוח תמונה לשימוש ניקוד אוטומטי42,43,44,45,46. בפרוטוקול זה, פלטפורמת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה משמשת לניתוח מוקדי γ-H2AX בלימפוציטים של דם היקפי. השימוש במערכת ניקוד אוטומטית מונע הטיית ניקוד בין-מעבדתית ובין-משקיפה, בעוד שהיא עדיין מאפשרת רגישות מספקת כדי לזהות מינונים מתחת ל-1 Gy47. היתרון העיקרי של מערכת זו בהשוואה לתוכנת קוד פתוח בחינם לניקוד מוקדי הוא העובדה כי התהליך המלא מסריקת שקופיות ללכידה וניקוד הוא אוטומטי. הרעיון של מסווגים הניתנים לערעור ואחסן על-ידי המשתמש מבטיח יכולת רבייה המוסיפה מידה לא משוחדת של איכות לתוצאות. לכן, עבודה זו ממחישה כיצד ניתן להשיג תוצאות מוקדי γ-H2AX באמצעות שיטת סריקה וניקוד מיקרוסקופית אוטומטית אשר ניתן להשתמש בה כאשר דגימות דם מאנשים שעלולים להיות חשופים יתר על המידה מתקבלות על ידי מעבדות רדיוביולוגיה למטרות dosimetry ביולוגיות.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה למחקר ביו-רפואי של ועדת האתיקה של אוניברסיטת מערב קייפ – קוד BM18/6/12. 1. הכנת פתרונות48 פתרון קיבוע תאים (3% PFA ב- PBS) ללבוש את ציוד המגן האישי המתאים (PPE) ולעבוד במכסה אדים, להוסיף 20 גרם של paraformaldehyde ל 200 מ”ל של Hמזוקק 2O. לחמם את התערובת ל 60 °C כדי לסייע פירוק. לאחר PFA מומס, להוסיף 40 טיפות של 5 N NaOH בזהירות מעל 30 דקות כדי להתקרר לטמפרטורת החדר. הסתגלו ל- pH 7 באמצעות 1 M HCl והשלימו עד לנפח סופי של 250 מ”ל עם H2O מזוקק (aliquots ניתן לאחסן ב -20 °C (20 °C) למשך שנה אחת). הוסף 25 מ”ל מפתרון זה ל- PBS של 41.7 מ”ל כדי להרשות לעצמו פתרון PFA של 3%. 1% פתרון אלבומין סרום בקר (BSA): הוסף 10 גרם של BSA ל 1000 מ”ל של PBS ומערבבים עד להמסה. יש לאחסן ב-4 °C (72 שעות לכל היותר). פתרון Triton-X בריכוז של 1:500: הוסף 1 μL של Triton-X ל 500 μL של PBS, לאחסן ב 4 °C (5 °F) עד לשימוש (מקסימום 24 שעות). פתרונות נוגדנים נוגדן ראשי – אנטי-γ-H2AX בריכוז של 1:500: הוסף 1 μL של אנטי-γ-H2AX ל 500 μL של פתרון 1% BSA, לאחסן ב 4 °C (24 שעות לכל היותר). נוגדן משני – DAM-TRITC בריכוז של 1:1000: הוסף 1 μL של DAM-TRITC ל 1000 μL של פתרון 1% BSA, לאחסן ב 4 °C (4 °C) עד לשימוש (מקסימום 24 שעות). שלמה רוזוול פארק מכון הזיכרון (cRPMI) מדיה הוסף סרום בקר עוברי מסונן (FBS) ופניצילין-סטרפטומיצין למדיה RPMI 1640 בבקבוק סטרילי כדי לתת ריכוז סופי של 10% FBS ו 1% פניצילין-סטרפטומיצין. 2. הכנת דוגמאות הערה: עבור פרוטוקול זה, דגימות דם שלמות היקפיות נאספות על ידי venipuncture בצינורות איסוף ליתיום-הפרין ממתנדבים בוגרים בריאים (בהסכמה מדעת – BM18/6/12 ועדת האתיקה של המחקר הביו-רפואי של ועדת האתיקה של אוניברסיטת מערב הכף). לפני תחילת, ודא כי הדם ואת מדיום הצפיפות של 1.077 גרם / מ”ל התאקלמו לטמפרטורת החדר. בארון בטיחות ביולוגי מוכן, לדלל את הדם כולו ההיקפי בנפח 1:1 עם PBS בעדינות שכבה הדם המדולל על נפח שווה לשני כרכים של בינוני עם צפיפות של 1.077 גרם / מ”ל. חשוב בהדרגה שכבה את הדם על מדיום הצפיפות על ידי החזקת הצינור מנוקד ב 45 °, להבטיח כי הדם ואת הצפיפות בינוני לא לערבב. מעבירים בזהירות את ההשעיה לצנטריפוגה ומסתובבים ב-900 x גרם למשך 20 דקות. לאחר מכן, pipette השכבה ‘מעונן’ רק לצינור חרוטי סטרילי חדש ולמלא את הצינור עם PBS וצנטריפוגה במשך 10 דקות ב 1000 x g. לאחר מכן, לשאוף supernatant עם pipette, להיות זהיר לא להפריע את הכדור, resuspend גלולה PBMC בזהירות 1 מ”ל PBS ולמלא את הצינור עם PBS. חזור על שלב הכביסה לעיל פעמיים נוספות כדי להגיע לסך של שלוש כביסות. לספור את מספר PBMCs באמצעות hemocytometer, מודע לכך שכל mL של דם היקפי מתורם מבוגר יגרום לממוצע גס של 1 – 1.5 x 106 PBMCs49. לאחר הספירה, לדלל את גלולה PBMC לריכוז של 8 x 105 לימפוציטים ב 1 מ”ל של cRPMI. לאחר מכן הוסיפו כ-2 x 106 מחשבים אישיים או 2.5 מ”ל מפתרון PBMC המבודד לצינור סטרילי וחרוטי להקרנות. 3. הקרנות לדוגמה זהירות: לטפל ביחידת הקרינה על פי הנחיות הגנת הקרינה וללבוש dosimeter פיזי בכל עת. ודא כי מערכת ההקרנה בשימוש מכויל ולהגדיר כך המינונים הצפויים הנכונים מושגים. הקרנת מחשבי PBMCs בטמפרטורת החדר באמצעות מקור 60Co. כיול (פרוטוקול TRS-398) עם תא Farmer 117 שעבורו גורם כיול קאמרית שהתקבל מהמכון הלאומי למטרולוגיה של דרום אפריקה (NMISA)50. לבדיקה זו, הנח את הצינורות החרוטיים בין גיליון אקרילי 5 מ”מ (המשמש להצטברות כניסת קרן) לבין חומר גב 50 מ”מ עם קצב המינון הנוכחי של 60Co מקור של 0.57 Gy/ min עבור 300 מ”מ × 300 מ”מ גודל שדה הומוגני 300 מ”מ ב 750 מ”מ מקור למרחק פני השטח. להקרין את ה- PBMCs עם מינונים מדורגים של 0.125, 0.500, 1.000, 1.500 ו 2.000 Gy, ולשמור על דגימות בקרה מוקרן מזויף, בחדר הבקרה, מקבל רק חשיפה לקרינה סביבתית. לדגור את הדגימות המוקרן במשך שעה אחת ב 37 °C בחממה לחה 5% CO2 על מנת להגיע למספר המרבי של מוקדי γ-H2AX.הערה: ניתן לשנות את זמן הדגירה בהתאם לתכנון ניסיוני. 4. הכנת שקופיות הערה: ראה איור 1 להגדרת שקופית. הכן 3 שקופיות (חזרות טכניות) באמצעות שקופיות מצופות במשטח טעון חיובית כדי לשפר הידבקות לכל מצב הקרנה (או לכל צינור חרוט). מקם את השקופית לתוך מחזיק הקליפ, הוסף את כרטיס המסנן מעליה ולבסוף את המשפך. אבטחו את קטעי השקופיות והכניסו את הציטוצנטריפוגה. הוסף 250 μL של השעיית התא משפך (200,000 תאים / שקופית) ולסובב עבור 30 x g במשך 5 דקות באמצעות cytocentrifuge. לאחר cytocentrifugation, להסיר את השקופית מן מחזיק קליפ באמצעות עט הידרופובי, לצייר עיגול סביב הנקודה עם התאים על מנת לשמור על כתם immunofluorescent על התאים הכרוכים במהלך תהליך הכתם. 5. קיבעון ואימונופלואורסצנטיות γ-H2AX מכתימים הערה: כל הפתרונות מתווספים בקפידה ישירות לאזור התא המסומן על ידי מעגל הידרופובי. פתרונות כתמים מחולקים מעט מעל השקופית מבלי לאפשר לקצה הפיפטה לשבש את התאים. פתרונות אינם מתווספים לשקופית כולה. תקן את השקופיות ב- 3% PFA מוכן טרי במשך 20 דקות.הערה: ניתן לאחסן את השקופיות ב- PBS המכילות 0.5% PFA ב- 4 °C למשך יומיים לכל היותר לפני ביצוע החיסונים. לאחר מכן, לשטוף שקופיות בצנצנת קופלין עם PBS במשך 5 דקות, ולאחר מכן לכסות את התאים עם 100 μL של פתרון Triton-X קר במשך 10 דקות כדי לאפשר permeabilization. הטפו את תמיסת טריטון-X על נייר טישו ושטפו את השקופיות שלוש פעמים בתמיסת BSA של 1% למשך 10 דקות. פעולה זו נעשית כדי למנוע רקע לא רצוי על ידי חסימת כריכת נוגדנים לא-מדעיים. דגירה מחליקה בטמפרטורת החדר עם 100 μL של 1:500-מדולל אנטי-γ-H2AX נוגדן במשך שעה בתא לחות, מושג בקלות על ידי הוספת נייר טישו רטוב בבסיס תיבת אחסון שקופיות מלבנית. הטפו את תמיסת הנוגדנים על נייר טישו ובצעו שלוש שטיפות עם תמיסת BSA של 1% למשך 10 דקות בצנצנת קופלין כדי להסיר נוגדן ראשוני לא מאוגד ולמנוע כריכה לא ספציפית של הנוגדן המשני. דגירה שקופיות עם 100 μL של 1:1000-מדולל DAM-TRITC פתרון נוגדן במשך שעה אחת בתא לחות. הטפו את תמיסה נוגדן על נייר טישו לשטוף את השקופיות PBS במשך 10 דקות שלוש פעמים. לבסוף לייבש את השקופיות מחוץ למעגל הידרופובי עם נייר טישו רך, ללא אבק ולהוסיף 1-2 טיפות של DAPI נפתר במדיום הרכבה מימית בעדינות לכסות את השקופית עם 24 x 50 מ”מ כיסוי להחליק, להבטיח כי אין בועות אוויר לכודים ומניחים במקרר ב 4 °C (5 °F) לילה. ניתן לאחסן שקופיות במהירות של 4 °C (70°F) למשך שבועיים לכל היותר לפני הסריקה. 6. סריקה וניקוד אוטומטיים של שקופיות הערה: מערכת הסריקה צריכה להיות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מצלמת CCD ברזולוציה גבוהה (התקן מצמיד טעון) המחוברת לתפיסת מסגרת לדיגיטציה בזמן אמת של תמונות וידאו, שלב סריקה, כדור עקיבה לתנועות ידניות, עכבר תלת-ממד, מחשב מהיר וצג וכונן קשיח לאחסון בארכיון (איור 2). כיוונון מסווגהערה: המסווג הוא קבוצה של פרמטרים המגדירים כיצד המערכת מזהה תאים. התוצאה היא ההכשרה המבוססת על שדות תמונה מסווגים מראש. מסווג הוא ספציפי עבור הגדלה מיקרוסקופ, סוג תא, ומעבדה. לכן מסווגים עשויים לדרוש שינויים בפרמטרים הבאים כדי להתאים אותם לתנאים הנוכחיים. מומלץ לבדוק את ההגדרות באמצעות שקופית הפניה לפני ההערכה. רכישת תמונה: השתמש במטרה יבשה פי 40 להדמיה. כדי להשיג איכות תמונה דומה בכל התאים, הגדר את זמן שילוב המצלמה למצב אוטומטי. הגדר את זמן האינטגרציה המרבי לשניה אחת לפחות עבור שני ערוצי הצבע (מצלמה להשיג 4.0). ערוץ האות נרכש עם 10 מטוסי מיקוד ו 14/40 מיקרומטר בין המטוסים. בחירת תאים: מחשבי PBMCs בטווח של 20.00 מיקרומטר2 ו 76.00 מיקרומטר2 מזוהים. הגדר את עומק הקשוב המרבי ל- 0.05 ואת יחס הגובה-רוחב המרבי ל- 1.4. הגדר את סף הרמה האפורה היחסית ל- 20%. עיבוד תאים: עבד את ערוץ הנגד DAPI באמצעות אלגוריתם מרבי של היסטוגרמה כדי להפחית את הרקע. ערוץ האות מעובד עם מסנן TopHat (חוזק 7, גורם החלקה 0) כדי להפחית את הרקע ולשפר את האותות. ספירת אותות: ספירת מוקדים באמצעות התכונה ‘ספירת אובייקטים’ של ההתקן. כדי להימנע מהערכה שגויה-חיובית של אותות הרקע הנותרים, רק האותות המראים לפחות 30% מהעוצמה בהשוואה לאובייקט הבהיר ביותר בתא נספרים. הכנס/הנח שקופיות על משטח הסריקה האוטומטי או שלב השקופית, לאחר ניקוי עדין עם 70% אתנול, כדי להסיר אבק. הגדרת שקופית – פתיחת תפריט דו-שיח של הגדרת שקופית (איור 3) בחר את נתיב הנתוניםהנכון , פעולה זו מציינת היכן מאוחסנים קבצי השקופיות הנובעים מהחיפוש. תן לשקופית שם, יש לתת לכל שקופית שם ייחודי. אם סדרת שקופיות מוזנת בצורה של רשימה ממוספרת, ניתן להשתמש ב- ‘?’ כתווים כלליים עבור מספר השקופית. בחר את המסווג המתאים, כמתואר בסעיף 1.1 – 1.4 (איור 4). בחר את חלון החיפוש ובחר מוגדר מראש אם קיימת הגדרת חלון חיפוש התואמת לעיגול התאים cytocentrifuge, בחר את ההגדרה המתאימה בעמודה גודל או בחר ידני אם אין הגדרת חלון חיפוש מוגדרת מראש זמינה. במקרה זה, אין להגדיר את העמודה גודל. בחר מספר תאים מרבי והוסף את המספר המרבי של תאים הדרושים לסריקה. החיפוש מסתיים גם אם חלון החיפוש שנבחר טרם נסרק לחלוטין ברגע שהגעת לספירת התאים המרבית. עבור יישומי ביו-דאודומטריה, די ניקוד אוטומטי של 1,000 תאים לשקופית, בהתחשב בכך ש-3 שקופיות לכל דגימת דם מוכנות. לחץ על אישור כדי לאשר את ההגדרות. הגדרת סריקת שקופיות לחץ על לחצן חיפוש בסרגל הצדדי. אם ההגדרה חלון חיפוש ידני נבחרה בהגדרת שקופית, ייפתח דו-שיח המאפשר קביעת אזור הסריקה (איור 5). באמצעות המטרה 10x, בחר את אזור החיפוש המלבני בשקופית באופן אינטראקטיבי על-ידי תיקון שתי פינות בשדה החיפוש בלחיצה שמאלית של העכבר. ניתן לאשר זאת באמצעות לחצן אישור. אם חלון החיפוש מפנה לחלון חיפוש מוגדר מראש, שלב זה יושמט. המשתמש מתבקש להתאים מיקום התחלה של המוקד. לאחר מכן ייבחר אובייקט הפניה באופן אוטומטי, התוכנה תבקש מהמשתמש להתמקד ולמרכז גרעין הפניה (באמצעות המטרה 40x) עבור כל שקופית ולאשר הגדרות עם אישור. המערכת תעבור באופן אוטומטי לכל השקופיות ברצף. במידת הצורך, התאם את הגדרת התמונה החיה – זמן האינטגרציה עבור שלב זה (איור 5). בדוק את כל הגדרות המיקרוסקופ ואשר את בקשת המערכת עם אישור. המערכת תתחיל את הליך המיקוד והסריקה האוטומטי. לאחר השלמת הסריקה, הנתונים נשמרים במחשב לצורך ניתוחים. מערכת הסריקה נכבית באופן אוטומטי לאחר השלמת הסריקה.הערה: ודא כי הידית של צינור המיקרוסקופ נמצאת במצב המסיט את כל האור למצלמה. חיפוש סוף, החיפוש מסתיים אם החיפוש כולו נסרק, אם ספירת התאים המרבית הגיעה או אם החיפוש בוטל. ניתוח שקופיותהערה: הסריקה שהושלמה מיוצגת באיור 6. לאחר השלמת הסריקה, לחץ על לחצן גלריה בסרגל הצדדי. סקור את הגלריה, המורכבת מתמונות קטנות של תאים שזוהו. בחלון זה (איור 7), ציין אם התאים המאוחסנים בגלריה לפי קריטריון שייבחרו מתפריט נפתח. תאים מוצגים בדרך כלל בסדר שבו הם זוהו. לחץ על דיאגרמת ערך היסטוגרמה/תכונה איכותית (איור 8) כדי לתת את התפלגות מדד האיכות עבור התאים שזוהו, כמו גם את האמצעים, ואת סטיית התקן של המוקדים.

Representative Results

עבור פרוטוקול זה, תאים מונונוקלאריים דם היקפי אנושי (PMBCs) היו מבודדים מדם שלם של ארבעה מתנדבים בוגרים בריאים ונחשפו למינוני קרינה של 0.125, 0.250, 0.500, 1.000 ו 2.000 Gy. לאחר מכן, הדגימות היו דגירה במשך שעה אחת ב 37 °C (5 °F) בחממה 5% CO2 לח. בעקבות קיבעון והכתמת אימונופלואורסצנטיות, השקופיות נסרקות באופן אוטומטי ומבקיעות. איורים 6, 7 ו- 8 נותנים ייצוג של מה שהתוכנה מפיקה למשתמש. חלון ניתוח מופיע לאחר השלמת הסריקה, מה שנותן סקירה כללית של המוקדים שהבקיעו. הגלריה נותנת את כל המוקדים שקיבלו ציון עם תפריט אינטראקטיבי שיכול למחוק חריגים ולבסוף ניתנת היסטוגרמה עם סיכום נתונים מפורט. מניית המוקדים γ-H2AX לאחר חשיפה לקרני γ מוצגת באיור 9. חלה עלייה הדרגתית במספר מוקדי γ-H2AX עם מינון הולך וגדל. גרף זה אינו רק ממחיש את התלות במנה ואת הרגישות של ההבחנה, אלא ניתן להשתמש בהתאמה גם כדי לבצע הערכת מינון כאשר מדגם מתקבל מאדם שנחשף למנה לא ידועה. חשוב לציין כי אחד לא יהיה שליטה מוקרן מזויף או רמות מוקדי רקע עבור אדם זה. לכן, איור 9 כולל את הערך 0 Gy של דגימות בקרה מוקרן מזויף, אשר היה 0.57 ± 0.23 Gy עבור ארבעת התורמים הבוגרים במחקר זה. איור 1: הכנת שקופיותלצנטריפוגה ציטו. מקם את השקופית לתוך מחזיק הקליפ, הוסף את כרטיס המסנן מעליה ולבסוף את המשפך. אבטחו את קטעי השקופיות והכניסו את הציטוצנטריפוגה. לאחר cytocentrifugation, להסיר את השקופית ממחזיק קליפ ולצייר עיגול סביב המקום עם התאים באמצעות עט הידרופובי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 2: פלטפורמת הסריקה האוטומטית ששימשה בפרוטוקול זה, המכילה סורק אוטומטי המחובר למיקרוסקופ פלואורסצנטי. איור 3: תפריט להגדרת שקופיות. פתח את תיבת הדו-שיח על-ידי לחיצה על לחצן SETUP בסרגל הצד. בחר או הזן את ספריית היעד עבור קבצי התוצאות נא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 4: תפריט הגדרת מסווג. ודא שהגדרות המסווג שנבחרו תואמות לסוג התא הנוכחי, לתנאי ההכנה ולדפוסי הכתמים של המדגם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 5: תפריט התקנה עבור חלון חיפוש ידני. החלון נבחר בהגדרת שקופית; ייפתח דיאלוג המאפשר קביעת אזור הסריקה. באמצעות המטרה 10x, אזור החיפוש המלבני בשקופית נבחר באופן אינטראקטיבי על-ידי תיקון שתי פינות בשדה החיפוש בלחיצה שמאלית של העכבר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 6: חלון הניתוח, לאחר השלמת הסריקה, חלון הניתוח מציג את תוצאות הסריקה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 7: תצוגת גלריה עבור השקופית שנבחרה. הכרטיסיה גלריה נמצאת בסרגל הצדדי. גלריית התמונות מורכבת מתמונות קטנות של התאים שזוהו, המוצגות כתמונה משולבת של DAPI-TRITC. בפינה השמאלית הימנית התחתונה של כל תמונה מוצגים ספירת המוקדים הישירה וספירת המוקדים המתוקנים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 8: תמונות היסטוגרמה עבור השקופית שנבחרה. חלון זה נפתח על-ידי לחיצה באמצעות לחצן העכבר הימני על היסטוגרמה. על ידי לחיצה על היסטוגרמה, גליון הכרטיסיות היסטוגרמה מספק סיכום נתונים המפרט את הממוצע, סטיית התקן, מקדם השונות, הערכים המינימליים, המקסימליים והחניים של התאים המנותחים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה. איור 9: מספר מוקדי γ-H2AX כפונקציה של מינון ללימפוציטים שנחשפו ל-60 קרני γ Co. סרגלי השגיאה הם סטיות התקן המייצגות את השונות הבין-ממדית בין התורמים. הנתונים מייצגים את המספר הממוצע של מוקדי γ-H2AX ± סטיית התקן של ארבעה מתנדבים בריאים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה מתאר הליך צעד עבור הניקוד האוטומטי מבוסס מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של γ-H2AX foci assay. זה ממחיש את התועלת של בדיקת המוקד כשיטה יעילה בזמן לניתוח מספר ה- DNA DSB המושרה בקרינה בלימפוציטים דם היקפיים כדי לבצע הערכת מינון ביולוגי בתרחיש של תאונת קרינה שבו אנשים עלולים להיחשף לרמות לא ידועות של IR.

בפרוטוקול ספציפי זה, מחשבים אישיים היו מוקרן במבחנה כדי לחקות חשיפה לקרינה in vivo. לאחר ההקרנה וזמן הדגירה של שעה אחת הושלמו, שקופיות נעשות באמצעות cytocentrifuge כדי ליצור נקודת ריכוז של תאים על השקופית. השימוש בציטוצנטריפוגה חיוני להשגת תנאים סטנדרטיים לניקוד אוטומטי. כאשר הושלם, עט הידרופובי משמש כדי להפוך את המעגל סביב התאים, כדי להפחית בזבוז של ריאגנטים על ידי מתן אפשרות למשתמש למקם את ריאגנטים מכתימים. סוג זה של עט יכול לשמש בטכניקות חיסוניות שונות כגון על מקטעי פרפין, קטעים קפואים ותכשירים ציטולוגיים. יתר על כן, חשוב לבחור עט הידרופובי התואם למערכות זיהוי מבוססות אנזימים ופלואורסצנטיות. לאחר הכנת שקופית, הקיבעון וההכתמה האימונופלואורסצנטית γ-H2AX התרחשו. בפרוטוקול זה, התאים קבועים באמצעות 3% PFA בפתרון PBS במשך 20 דקות. כדי שהחיסון יצליח, חיוני שהמורפולוגיה של התאים תישמר ושהאתרים האנטיגניים נגישים לריאגנטים לזיהוי הנמצאים בשימוש. PFA הוא סוכן עדין יחסית עבור קיבעון ומייצב תאים תוך שמירה על מבני חלבון51. ניסויי אופטימיזציה עם ריכוזי PFA גבוהים יותר ותקופת קיבעון ארוכה יותר הביאו להשפעה שלילית על איכות השקופית, אך אחסון נוסף (בן לילה) ב- 0.5% PFA עד 24 שעות הניב תוצאות טובות.

הנוגדן העיקרי, 2F3 חד שבטי המשמש בפרוטוקול זה מגיב לגרסת Histone H2AX כאשר זרחן בסרי 139 לאחר אינדוקציה DSB DNA. הנוגדן מסוגל להיקשר לשאריות הזרחן ללא תגובתיות צולבת עם היסטונים זרחניים אחרים52. מכיוון שמדובר בנוגדן חד שבטי ראשוני של העכבר, נבחר נוגדן משני נגד המינים המארחים של הנוגדן העיקרי תוך גידול במארח חלופי, כלומר חמור-נגד עכבר (DAM)-TRITC. בעוד כתמים אימונופלואורסצנטיים מבוססים על כריכת נוגדנים-אפיטופ ספציפית, מספר כוחות בין-מולקולריים יכולים גם לגרום להכתמת רקע לא ספציפית. על מנת להפחית כריכה לא ספציפית, חשוב להשתמש ריאגנט חסימה בפרוטוקולי כתמים immunofluorescent53; השתמשנו בפתרון BSA. יתר על כן, יש להקצות מספיק זמן לשלב חסימה זה על ידי השארת השקופיות בפתרון לפחות 20 דקות לפני כתמי נוגדנים ראשוניים ומשניים. בנוסף, פתרון BSA צריך לשמש גם כדילול עבור הנוגדנים העיקריים והמשניים. בהתאם אנטי-γ-H2AX ונוגדן משני המשמש להכתמה, יש לשקול בדיקת דילול נוגדנים שונים על מנת לקבוע את הריכוז האופטימלי. לניקוד מדויק יותר, ניתן לבצע כתמים כפולים, על ידי הוספת נוגדני חלבון נוספים לתיקון DNA DSB.

חיסרון מרכזי של סוג זה של ניתוח הוא הצורך לרכוש דגימות דם בהקדם האפשרי לאחר החשיפה, כמו המספר המרבי של מוקדים ידוע לרדת בחזרה לרמות נורמליות בתוך 48 שעות לאחר הקרנה. לכן, כאשר זמן תאונת הקרינה ודגמת הדם הבאה ידוע, זה יכול להיות שימושי לעבוד עם עקומות כיול שונות שנקבעו בנקודות זמן שונות לאחר הקרנה במבחנה (למשל, 4, 8, 12 ו 24 שעות). עם זאת, כפי שכבר צוין בסעיף המבוא של כתב היד, כוחו של γ-H2AX מוקדי assci טמון במטרות מיון ראשוניות ומהירות ויש להשתמש בו כדי לתעדף יותר זמן דוסומטריה ביולוגית ציטוגנטית. תרחיש משולב שבו משתמשים בסמנים ביולוגיים מרובים במקביל, ייצור את הערכת המינון האמינה ביותר ומעבדות ביו-דאודומטריה שונות ברחבי העולם איחדו כוחות כדי להקים רשתות ארציות שניתן להפעיל ולהשתמש בהן כדי לאפשר הערכות ביו-דומימטריות מקבילות מרובות על ידי מעבדות עם מומחיות שונה37,54,55 . בנוסף, נמשכות התפתחויות לניתוח מהיר במיוחד כגון מעבדה ניידת באתר התאונה56או בסמוך לו . שיטות ביו-מדידת ביולוגיות חדשות ומבטיחות מפותחות כל הזמן, מה שבתקווה יביא לתפוקה מהירה ואמינה עוד יותר בעתיד57.

עבור מערכת ניתוח התמונה האוטומטית, שקופיות מוכנסות או ממוקמות על פלטפורמת הסריקה האוטומטית או על שלב השקופית. לאחר מכן, תן שם ושמור את פרטי השקופית בתיקיה המתאימה במחשב המצורף. עבור ניסוי זה, גרעינים אוטומטיים וזיהוי מוקדים מבוססים על הגדרות המסווג המתאימות. ביצירת מסווג, ודא שהגדרות המסווג שנבחרו תואמות לסוג התא הנוכחי, לתנאי ההכנה ולהכתמת ה- immunofluorescent של המדגם. ערוצי פלורסנט מתאימים התואמים את ספקטרום העירור של הנוגדנים העיקריים והמשניים מוגדרים במסווג. המסווג מאפשר לקבוע פרמטרי ניקוד נוספים במידת הצורך (לדוגמה, גודל גרעין, עוצמת פלואורסצנטית, כמתואר בסעיף 6.1). אם שני חלבונים או יותר לתיקון דנ”א (למשל, γ-H2AX ו-53BP1) משולבים בניסוי, המערכת מסוגלת גם לזהות לוקליזציה משותפת של אותות. ראשית, המערכת רוכשת תמונות DAPI, מחילה עיבוד תמונה ומזהה גרעינים באמצעות קריטריונים מורפולוגיים המוגדרים במ המסווג. אותות TRITC נרכשים באמצעות 10 z-ערימות עם גודל צעד של 0.35 מ”מ בין מישורי המוקד47. המסווג השתמש בספירת המוקדים הישירים, שם ציון מספר האותות המובהקים של TRITC בתוך הגרעין. כאן, חשוב לקחת בחשבון כי עם הגדלת מינון הקרינה, אותות מוקד נוטים להתמזג לתוך אובייקטים גדולים יותר, וכתוצאה מכך לזלזל במספר המוקדים בפועל אם אובייקטים נספרים ישירות. זה לא נדרש לניתוח המתואר כאן, אבל צעד נוסף עם ספירת מוקדים מתוקן ניתן ליישם כדי לפתור בעיה זו. זה האחרון מאפשר למערכת להשיג את הגדלים של האותות שזוהו ושוקל אותם בהתאם. באמצעות שתי שיטות הספירה יכול לספק הערכה מציאותית יותר של מספר המוקדים בפועל במינונים גבוהים יותר.

כדי להתחיל בסריקה אוטומטית, אזור הסריקה נקבע על-ידי שימוש במטרה 10x של המיקרוסקופ כדי ליצור אזור חיפוש מלבני על-ידי תיקון שתי פינות בשדה החיפוש בלחיצה שמאלית של העכבר (איור 5), ואחריו מיקוד מיקום ההתחלה. אובייקט ההפניה נבחר באופן אוטומטי, והתוכנה מבקשת מהמשתמש להתמקד ולמרכז גרעין הפניה (באמצעות המטרה 40x) עבור כל שקופית. לאחר תחילת החיפוש, המערכת תעבור למרכז חלון החיפוש של השקופית הראשונה שנבחרה ותבקש למרכז ולמקד את אובייקט ההפניה. אובייקט זה ישמש מאוחר יותר כהפניית מיקום לתיקון כל תזוזה במיקומים של התא. המטרה השנייה של שדה הייחוס היא כוונון האור האוטומטי, במצב אור משודר האור מותאם עד לרמת האור האופטימלית. במצב פלואורסצנטיות רמת האור קבועה, אך ניתן להגדיל את זמן האינטגרציה של מצלמת ה- CCD עד לאות הנדרש. כדי לאפשר התאמת אור נכונה, ההפניה צריכה להכיל אובייקטים עם כתמים אופייניים. חשוב לא להשתמש בשדה שיש בו חפצים בעוצמה גבוהה מאוד של כתמים. לאחר התאמת האור, המערכת מפעילה את הפוקוס האוטומטי של הרשת במיקום הרשת הקרוב ביותר לשדה הייחוס. הוא ממשיך למקד שדות ברשת רגילה, נע בהתפתלות לכיוון החזית והחלק האחורי של חלון החיפוש. הסריקה מתחילה עם השלמת מיקוד אוטומטי של הרשת. השלב מועבר בשדה תבנית מתפתל אחרי שדה כדי ללכוד נתונים. כאשר מזוהה תא, מיקומו ותמונת הגלריה שלו מאוחסנים ומוצגים על המסך וספירת התאים מתעדכנת. אם מתרחשת שגיאת מיקרוסקופ, שלב או מאכיל, החיפוש מבוטל באופן אוטומטי. השלב היחיד שבו יש התערבות ידנית של האופרטור, הוא במהלך הגדרת סריקת השקופיות. זו גם הנקודה שבה מתבצעת בדיקת בקרת איכות מהירה (בועות אוויר, מספרי תאים נמוכים, דהייה של חפצי הכתמת האות הפלואורסצנטיים) ושם ניתן להחליט לבטל את הסריקה של שקופית באיכות נחותה. חיפוש מסתיים אם השקופית כולה נסרקה, אם הגיעה ספירת התאים המרבית או אם החיפוש בוטל. לאחר השלמת הסריקה, הנתונים מוצגים כפי שניתן לראות ב- איור 6. כדי להציג תאים סרוקים, חלון הגלריה נפתח וניתן להציג כל תא (איור 7). זוהי נקודה נוספת שבה המפעיל יכול לבצע בקרת איכות על-ידי בדיקת המוקד של תמונות הגלריה ואת המספר הכולל של תאים שהבקיעו. אם תאים רבים מדי אינם ממוקדים או שתאים מעטים מדי זוהו על ידי המערכת כדי לבצע הערכת מינון מציאותית (למשל, 100 תאים במקום 1000 התאים המיועדים), אז יש לקבל את ההחלטה להוציא את השקופית ואת הניקוד האוטומטי מההערכה הסופית. כל הנתונים מסוכמים בהיסטוגרמה (איור 8), יחד עם מידע על ההפצה, האמצעים וסטיית התקן של מוקדי הציון עבור כל תא. היסטוגרמה יכולה לשמש גם כדי לבחור ולהציג אוכלוסיות משנה של גרעינים בהתבסס על הממצאים האוטומטיים לסקירה. ניתוחים סטטיסטיים על התוצאות מבוצעים לאחר ההתפלגות, ממוצע, ואת סטיית התקן של המוקד מספר לתא נרשמו באופן ידני. הגרף יכול לשמש כעקומת כיול לביצוע הערכת מינון של דגימת ביו-דאודומטריה. זה יכול להיעשות באמצעות המשוואה של קו המגמה כדי לבצע הערכה משוערת של המינון שהתקבל. כמו איור 9 ממחיש כי הסריקה האוטומטית רגישה מספיק כדי לזהות מוקדים המושרים במינונים נמוכים. יתר על כן, התוצאות מראות עלייה ליניארית ברורה של מספר המוקדים לתא עם מינון. יש לציין כי התוצאות מייצגות רק עבור המסווג המשמש, התוצאות יהיו שונות עבור פרמטרים מסווגים שונים. לכן, במקרה של ניתוח ביו-דאודומטריה, חשוב כי אותו מסווג והכנת שקופית ישמשו עבור דגימות biodosimetry כמו אלה ששימשו כדי להקים את עקומת הכיול המשמש לביצוע הערכת המינון. אמנם זה היה מחוץ לטווח של מחקר זה, חשוב לציין כי γ-H2AX foci assay יכול לשמש גם כדי לקבוע קרינות גוף חלקיות. רוב החשיפות לקרינה בשוגג הן חשיפות גוף לא הומוגניות או חלקיות, כאשר רק אזור מקומי בגוף קיבל חשיפה במינון גבוה. מספר מחקרים המחישו כי ניתן להשתמש בבדיקת המוקדים γ-H2AX כדי להעריך את שבר הגוף שהוקרן ואת המינון לשבר המוקרן42. כאשר הקרנה של כל הגוף מתרחשת, תהיה אינדוקציה אקראית של DNA DSB בכל התאים ואפשר לצפות למצוא התפלגות פואסון. בדומה לשיטות ציטוגנטיות שבהן האינדוקציה של סטיות כרומוזומליות נוטה להיות מפוזרת יתר על המידה בלימפוציטים דם היקפיים שבהם יש שפע גבוה של תאים עם סטיות מרובות ותאים עם גרורות רגילות, ניתוח פיזור של מוקדי γ-H2AX באמצעות שיטת פואסון מזוהמת המוצעת על פני התפלגות מוקדים מפוזרת58. האחרון אושר גם ב in vivo ניסויים עם מיניפיגים ומקוק רזוס59.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות למשתתפי המחקר על תרומות הדם שלהם, כמו גם האחות V. פרינס לאיסוף דגימות דם. הסיוע הכספי של קרן המחקר הלאומית של דרום אפריקה (NRF) למחקר זה מוכר בזאת. דעות שהובעו, והמסקנות הגיעו, הן של המחברים ולא בהכרח להיות מיוחסות ל- NRF. עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי הסוכנות הבינלאומית לאנרגיה אטומית (סבא”א), באמצעות פרויקט שיתוף פעולה טכני (מספר: URU6042) לתמיכה ב- W. Martínez-López, כמו גם בפרויקט המחקר המתואם E35010 (מספר חוזה: 22248).

Materials

Bovine serum albumin – BSA Merck A3059
Coplin Jar Sigma S6016
Cover Slips (Size 24 x 50 mm) Lasec Glass2C29M2450Rec
Cryogenic Vials (1.2 mL) WhiteSci 607101
Cytospin Healthcare Technologies JC370-12-L
Cytospin Clips Healthcare Technologies JC302
Cytospin filter cards Healthcare Technologies JC307
Cytospin Funnels Healthcare Technologies JC372
DAM-TRITC Invitrogen A16022
DAPI-Fluroshield Sigma/Merck F6057
Ethanol Kimix ETD901
Filter tips WhiteSci  200ul (312012) and 1000ul (313012)
Hydrochloric acid- HCl Merck
Histopaque Sigma/Merck 10771
lithium–heparin collection tubes The Scientific Group 367526
MetaSystems – Metafer Metasystems Azio Imager Z2: 195-041848
NaOH Merck 221465
NovoPen Leica Biosystems NCL-PEN
Paraformaldehyde Sigma/Merck 158127
Phosphate-buffered saline Tablets Separations SH30028,02
Pipettes WhiteSci P11037 and P1033 X-tra Clipped Corner Slides are clipped at 45° angles to help reduce glass breakage.
Purified anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody Biolegend 613402 / 100 μg
RPMI medium WhiteSci BE12-702F
Triton X-100 (Octoxinol 9) Sigma/Merck T-9284
Tubes (15ml) WhiteSci 601002
X-Tra adhesive slides – corner clipped SMM Technologies 3800200E
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Barnes, J. L., et al. Carcinogens and DNA damage. Biochemical Society Transactions. 46 (5), 1213-1224 (2018).
  2. Little, J. B. Radiation carcinogenesis. Carcinogenesis. 21 (3), 397-404 (2000).
  3. Barquinero, J. F., et al. Lessons from past radiation accidents: Critical review of methods addressed to individual dose assessment of potentially exposed people and integration with medical assessment. Environment International. 146, 106175 (2021).
  4. International Atomic Energy Agency. Radiotherapy in Cancer Care: Facing The Global Challenge. International Atomic Energy Agency. , (2017).
  5. Achel, D. G., et al. Towards establishing capacity for biological dosimetry at Ghana Atomic Energy commission. Genome Integrity. 7 (1), 1-5 (2016).
  6. Sullivan, J. M., et al. Assessment of biodosimetry methods for a mass-casualty radiological incident: Medical response and management considerations. Health Physics. 105 (6), 540-554 (2013).
  7. Rea, M. E., et al. Proposed triage categories for large-scale radiation incidents using high-accuracy biodosimetry methods. Health Physics. 98 (2), 136-144 (2010).
  8. Swartz, H. M., et al. A critical assessment of biodosimetry methods for large-scale incidents. Health Physics. 98 (2), 95-108 (2010).
  9. International Atomic Energy Agency. Cytogenetic Dosimetry: Applications in Preparedness for and Response to Radiation Emergencies. International Atomic Energy Agency. , (2011).
  10. Grégoire, E., et al. Twenty years of FISH-based translocation analysis for retrospective ionizing radiation biodosimetry. International Journal of Radiation Biology. 94 (3), 248-258 (2018).
  11. Moroni, M., et al. Evaluation of the gamma-H2AX assay for radiation biodosimetry in a swine model. International Journal of Molecular Sciences. 14 (7), 14119-14135 (2013).
  12. Rothkamm, K., et al. Laboratory Intercomparison on the γ-H2AX Foci Assay. Radiation Research. 180 (2), 149 (2013).
  13. Barnard, S., et al. The first gamma-H2AX biodosimetry intercomparison exercise of the developing european biodosimetry network RENEB. Radiation Protection Dosimetry. 164 (3), 265-270 (2015).
  14. Moquet, J., et al. The second gamma-H2AX assay inter-comparison exercise carried out in the framework of the European biodosimetry network (RENEB). International Journal of Radiation Biology. 93 (1), 58-64 (2017).
  15. Vinnikov, V., et al. Clinical Applications of Biomarkers of Radiation Exposure: Limitations and Possible Solutions Through Coordinated Research. Radiation Protection Dosimetry. 186 (1), 3-8 (2019).
  16. Mariotti, L. G., et al. Use of the γ-H2AX assay to investigate DNA repair dynamics following multiple radiation exposures. PLoS ONE. 8 (11), 1-12 (2013).
  17. Ivashkevich, A. N., et al. γH2AX foci as a measure of DNA damage: A computational approach to automatic analysis. Mutation Research – Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis. 711 (1-2), 49-60 (2011).
  18. Rogakou, E. P., et al. Megabase chromatin domains involved in DNA double-strand breaks in vivo. Journal of Cell Biology. 146 (5), 905-915 (1999).
  19. Sedelnikova, O. A., et al. Quantitative Detection of 125 IdU-Induced DNA Double-Strand Breaks with γ-H2AX Antibody. Radiation Research. 158 (4), 486-492 (2002).
  20. Han, J., et al. Quantitative analysis reveals asynchronous and more than DSB-associated histone H2AX phosphorylation after exposure to ionizing radiation. Radiation Research. 165 (3), 283-292 (2006).
  21. Jaworska, A., et al. Operational guidance for radiation emergency response organisations in Europe for using biodosimetric tools developed in EU multibiodose project. Radiation Protection Dosimetry. 164 (1-2), 165-169 (2015).
  22. Kulka, U., et al. Realising the european network of biodosimetry RENEB – status quo. Radiation protection dosimetry. 164 (1), 42-45 (2015).
  23. Sánchez-Flores, M., et al. γH2AX assay as DNA damage biomarker for human population studies: Defining experimental conditions. Toxicological Sciences. 144 (2), 406-413 (2015).
  24. Raavi, V., et al. Potential application of γ-H2AX as a biodosimetry tool for radiation triage. Mutation Research/Reviews in Mutation Research. 787, 108350 (2020).
  25. Lassmann, M., et al. In vivo formation of γ-H2AX and 53BP1 DNA repair foci in blood cells after radioiodine therapy of differentiated thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 51 (8), 1318-1325 (2010).
  26. Vandevoorde, C., et al. γ-H2AX foci as in vivo effect biomarker in children emphasize the importance to minimize x-ray doses in paediatric CT imaging. European Radiology. 25 (3), 800-811 (2015).
  27. Beels, L., et al. γ-H2AX foci as a biomarker for patient X-ray exposure in pediatric cardiac catheterization: Are we underestimating radiation risks. Circulation. 120 (19), 1903-1909 (2009).
  28. Bogdanova, N. V., et al. Persistent DNA double-strand breaks after repeated diagnostic CT scans in breast epithelial cells and lymphocytes. Frontiers in Oncology. 11, 1-14 (2021).
  29. Schumann, S., et al. DNA damage in blood leukocytes of prostate cancer patients undergoing PET/CT examinations with [68Ga]Ga-psma. Cancers. 12 (2), 1-14 (2020).
  30. Ivashkevich, A., et al. Use of the γ-H2AX assay to monitor DNA damage and repair in translational cancer research. Cancer Letters. 327 (1-2), 123-133 (2012).
  31. Moquet, J., et al. Gamma-H2AX biodosimetry for use in large scale radiation incidents: Comparison of a rapid “96 well lyse/fix” protocol with a routine method. PeerJ. 2014 (1), 1-11 (2014).
  32. Turner, H. C., et al. Adapting the γ-H2AX Assay for Automated Processing in Human Lymphocytes. Radiation Research. 175 (3), 282-290 (2008).
  33. Sharma, P. M., et al. High Throughput Measurement of γ H2AX DSB Repair Kinetics in a Healthy Human Population. PLoS ONE. 10 (3), 0121083 (2015).
  34. Vandevoorde, C., et al. EPI-CT: In vitro assessment of the applicability of the γ-H2AX-foci assay as cellular biomarker for exposure in a multicentre study of children in diagnostic radiology. International Journal of Radiation Biology. 91 (8), 653-663 (2015).
  35. MacPhail, S. H., et al. Cell cycle-dependent expression of phosphorylated histone H2AX: Reduced expression in unirradiated but not X-irradiated G1-phase cells. Radiation Research. 159 (6), 759-767 (2003).
  36. Barnard, S., et al. The shape of the radiation dose response for DNA double-strand break induction and repair. Genome Integrity. 4 (1), 1 (2013).
  37. Kulka, U., et al. Biodosimetry and biodosimetry networks for managing radiation emergency. Radiation Protection Dosimetry. 182 (1), 128-138 (2018).
  38. Macaeva, E., et al. Gene expression-based biodosimetry for radiological incidents: assessment of dose and time after radiation exposure. International Journal of Radiation Biology. 95 (1), 64-75 (2018).
  39. Khanna, K. K., et al. DNA double-strand breaks: Signaling, repair and the cancer connection. Nature Genetics. 27 (3), 247-254 (2001).
  40. Rothkamm, K., et al. γ-H2AX as protein biomarker for radiation exposure. Annali dell’Istituto Superiore di Sanita. 45 (3), 265-271 (2009).
  41. Borràs, M., et al. Comparison of methods to quantify histone H2AX phosphorylation and its usefulness for prediction of radiosensitivity. International Journal of Radiation Biology. 91 (12), 915-924 (2015).
  42. Horn, S., et al. Gamma-H2AX-based dose estimation for whole and partial body radiation exposure. PLoS ONE. 6 (9), 1-8 (2011).
  43. Costes, S. V., et al. Imaging Features that Discriminate between Foci Induced by High- and Low-LET Radiation in Human Fibroblasts. Radiation Research. 165 (5), 505-515 (2006).
  44. Leatherbarrow, E. L., et al. Induction and quantification of γ-H2AX foci following low and high LET-irradiation. International Journal of Radiation Biology. 82 (2), 111-118 (2006).
  45. Mistrik, M., et al. Low-dose DNA damage and replication stress responses quantified by optimized automated single-cell image analysis. Cell Cycle. 8 (16), 2592-2599 (2009).
  46. Oeck, S., et al. The Focinator – a new open-source tool for high-throughput foci evaluation of DNA damage. Radiation Oncology. 10 (1), 1-11 (2015).
  47. Vandersickel, V., et al. Early increase of radiation-induced γH2AX foci in a humanku70/80 knockdown cell line characterized by an enhanced radiosensitivity. Journal of Radiation Research. 51 (6), 633-641 (2010).
  48. Sambrook, J., et al. . Molecular cloning : a laboratory manual. , (2001).
  49. Rifai, A., et al. B and T lumphocytes. Recent Advances in IgA Nephropathy. (6), 193-210 (2009).
  50. Andreo, P., et al. Absorbed dose determination in external beam radiotherapy: An international code of practice for dosimetry based on absorbed dose to water. International Atomic Energy Agency. , (2001).
  51. Jamur, M. C., et al. Cell fixatives for immunostaining. Methods in Molecular Biology. 588, 55-61 (2010).
  52. Rogakou, E. P., et al. DNA Double-stranded Breaks Induce DNA Double-stranded Breaks Induce Histone H2AX Phosphorylation on Serine 139. Journal of Biological Chemistry. 273 (10), 1-12 (1998).
  53. Kyuseok, I. An introduction to Performing Immunofluorescence Staining. Methods in Molecular Biology. 1897, 299-311 (2019).
  54. Ainsbury, E. A., et al. Multibiodose radiation emergency triage categorization software. Health Physics. 107 (1), 83-89 (2014).
  55. Ainsbury, E. A., et al. Dose estimation software for radiation biodosimetry. Health Physics. 98 (2), 290-295 (2010).
  56. Turner, H. C., et al. The RABiT: High-throughput technology for assessing global DSB repair. Radiation and Environmental Biophysics. 53 (2), 265-272 (2014).
  57. Wang, Q., et al. Development of the FAST-DOSE assay system for high-throughput biodosimetry and radiation triage. Scientific Reports. 10 (1), 1-11 (2020).
  58. Rothkamm, K., et al. Leukocyte DNA damage after multi-detector row CT: A quantitative biomarker of low-level radiation exposure. Radiology. 242 (1), 244-251 (2007).
  59. Redon, C. E., et al. an analysis method for partial-body radiation exposure using γ-H2AX in nonhuman primate lymphocytes. Radiation Measurements. 46 (9), 877-881 (2011).

Tags

– Automated Microscopic Scoring- γ-H2AX Foci Assay- Human Peripheral Blood Lymphocytes- Ionizing Radiation- DNA Double-strand Breaks- H2AX Phosphorylation- Automated Slide Scanning- Fluorescent Microscopy- Lymphocyte Isolation- Density Gradient Centrifugation- Gamma Irradiation- Cytocentrifugation- Standardized Slide Preparation

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Nair, S., Cairncross, S., Miles, X., Engelbrecht, M., du Plessis, P., Bolcaen, J., Fisher, R., Ndimba, R., Cunningham, C., Martínez-López, W., Schunck, C., Vandevoorde, C. An Automated Microscopic Scoring Method for the γ-H2AX Foci Assay in Human Peripheral Blood Lymphocytes. J. Vis. Exp. (178), e62623, doi:10.3791/62623 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image