MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve Yukarıdan Aşağıya Proteomik Analiz kullanılarak Escherichia coli'de Antibakteriyel Bağışıklık Proteinlerinin Tanımlanması
Summary
Burada, maldi-TOF-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz kullanılarak genomik olarak sıralanmış patojenik bakteriler tarafından üretilen proteinlerin şirket içinde geliştirilen yazılımla hızlı tanımlanması için bir protokol sunuyoruz. Metastable protein iyonları, aspartik asit etkisi nedeniyle parçalanır ve bu özgüllük protein tanımlaması için yararlanılmıştır.
Abstract
Bu protokol bakterisidal enzimlerin bağışıklık proteinlerini tanımlar: antibiyotik indüksiyonu kullanılarak patojenik bir Escherichia koli suşu tarafından üretilen ve MALDI-TOF tandem kütle spektrometresi ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz ile şirket içinde geliştirilen yazılımla tanımlanan kolisin E3 ve bakteriyosin. Kolisin E3 (Im3) bağışıklık proteini ve bakteriyosin (Im-Bac) bağışıklık proteini, kuşkonmaz asit, glutamik asit ve kuşkonmaz kalıntılarının C-terminal tarafındaki polipeptid omurga bölünmesi (PBC) tarafından üretilen belirgin b ve/veya y tipi parça iyonlarından kuşkonmaz asit etkisi parçalanma mekanizması ile tanımlanmıştır. Yazılım, bakteri suşunun tüm genom diziliminden elde edilen siliko protein dizilerini hızla tarar. Yazılım ayrıca olgun protein dizisinin kesilmesi durumunda bir protein dizisinin amino asit kalıntılarını yinelemeli olarak giderir. Tek bir protein dizisi, her bağışıklık proteini için tespit edilenlerle tutarlı kütle ve parça iyonlarına sahipti. Aday sırası daha sonra algılanan tüm parça iyonlarının atanabileceğini onaylamak için el ile denetlendi. Im3’ün N-terminal metiyoni çeviri sonrası kaldırılırken, Im-Bac tam sıraya sahipti. Ek olarak, doğru protein dizisini tanımlamak için PBC tarafından oluşturulan sadece iki veya üç tamamlayıcı olmayan parça iyonlarının gerekli olduğunu gördük. Son olarak, bakteriyel suşun plazmid genomunda antibakteriyel ve bağışıklık genlerinin yukarı akışta bir promotör (SOS kutusu) tespit edildi.
Introduction
Sindirilmemiş proteinlerin kütle spektrometresi ile analizi ve tanımlanması yukarıdan aşağıya proteomik analiz1, 2,3,4olarak adlandırılır. Artık elektrospray iyonizasyon (ESI)5 ve yüksek çözünürlüklü kütle analizörleri6ve elektron transferi ayrışması (ETD), elektron yakalama ayrışması (ECD)7,ultraviyole foto-ayrışma (UV-PD)8,vb.
Diğer yumuşak iyonizasyon tekniği matris destekli lazer desorpsiyon/iyonizasyon (MALDI)9,10,11 yukarıdan aşağıya analiz için daha az yaygın olarak kullanılmıştır, çünkü kısmen diğer kütle analizörlerine kıyasla sınırlı çözünürlüğe sahip uçuş zamanı (TOF) kütle analizörleri ile birleştirilmiştir. Bu sınırlamalara rağmen, MALDI-TOF ve MALDI-TOF-TOF cihazları saf proteinlerin ve fraksiyone edilmiş ve kırılmamış protein karışımlarının hızlı yukarıdan aşağıya analizi için yararlanmıştır. Saf proteinlerin tanımlanması için, kaynak içi çürüme (ISD) özellikle yararlı bir tekniktir, çünkü ISD parça iyonlarının kütle spektrometresi (MS) analizine ve ayrıca genellikle hedef proteinin N ve C-terminisinden diziye özgü parça sağlayan protein iyon parçalarının tandem kütle spektrometresine (MS/ MS) izin verir, Edman dizileme12,13’e benzer . ISD yaklaşımının bir dezavantajı, Edman diziliminde olduğu gibi, numunenin yalnızca bir protein içermesi gerektiğidir. Tek protein gereksinimi, parça iyonlarının öncül bir iyona kesin bir şekilde atfedilmesi ihtiyacından kaynaklanmaktadır. Bir örnekte iki veya daha fazla protein varsa, hangi parça iyonlarının hangi öncül iyonlara ait olduğunu atamak zor olabilir.
Parça iyon/öncül iyon ilişkilendirmesi MALDI-TOF-TOF-MS/MS kullanılarak ele alınabilir. Her klasik MS/MS deneyinde olduğu gibi, öncül iyonlar parçalanmadan önce kitlesel olarak seçilir/izole edilir ve tespit edilen parça iyonları belirli bir öncül iyona bağlanabilir. Bununla birlikte, bu yaklaşım için mevcut olan ayrışma teknikleri öncelikle yüksek enerjili çarpışma kaynaklı ayrışma (HE-CID)14 veya kaynak sonrası çürüme (PSD)15,16ilesınırlıdır. HE-CID ve PSD en çok peptitlerin ve küçük proteinlerin parçalanmasında etkilidir ve dizi kapsamı bazı durumlarda sınırlı olabilir. Ek olarak, PSD öncelikle aspartik ve glutamik asit kalıntılarının C-terminal tarafında polipeptid omurga bölünmesi (PBC) ile sonuçlanır aspartik asit etkisi17 , 18,19,20.
MALDI-TOF-MS ayrıca mikroorganizmaların taksonomik tanımlamasında niş bir uygulama buldu: bakteri21,mantarlar 22ve virüsler23. Örneğin, MS spektrası, karşılaştırma için desen tanıma algoritmaları kullanarak bilinen bakterilerin MS spektrumlarının bir referans kütüphanesi ile karşılaştırıldığında bilinmeyen bakterileri tanımlamak için kullanılır. Bu yaklaşım, hızı ve basitliği nedeniyle son derece başarılı olmuştur, ancak bir gecede izolenin kültleştirilmesini gerektirmektedir. Bu yaklaşımla tespit edilen protein iyonları (genellikle 20 kDa’nın altında), cins ve tür düzeyinde ve bazı durumlarda alt türler24 ve suş seviyesi 25,26’dataksonomik çözünürlüğe izin sağlayan bir MS parmak izi içerir. Bununla birlikte, sadece taksonomik olarak potansiyel patojenik mikroorganizmaları sınıflandırmakla kalmayıp, aynı zamanda spesifik virülans faktörlerini, toksinleri ve antimikrobiyal direnç (AMR) faktörlerini de tanımlamaya ihtiyaç vardır. Bunu başarmak için peptitlerin, proteinlerin veya küçük moleküllerin kütlesi MS ile ölçülür ve daha sonra MS/MS tarafından izole edilir ve parçalanır.
Patojenik bakteriler genellikle plazmid adı verilen dairesel DNA parçaları taşırlar. Plazmidler, profilaktasyonlarla birlikte, bakteriler arasında yatay gen transferinin önemli bir vektörüdür ve antimikrobiyal direncin ve diğer virülans faktörlerinin bakteriler arasında hızla yayılmasından sorumludur. Plazmidler ayrıca kolitin ve bakteriyotin gibi antibakteriyel (AB) genler de taşıyabilir. Bu genler ifade edildiğinde ve proteinler salgılandığında, aynı çevresel niş işgal komşu bakterilerin protein çeviri makinelerini devre dışı bırakmak için hareket ederler27. Bununla birlikte, bu bakterisidal enzimler, onları üreten konak için de risk oluşturabilir. Sonuç olarak, bir gen, özellikle bir AB enziminin işlevini engelleyen ve bağışıklık proteini (Im) olarak adlandırılan konak tarafından birlikte ifade edilir.
Mitomycin-C ve sirofloksasin gibi DNA’ya zarar veren antibiyotikler genellikle Shiga toksin üreten E. coli’de (STEC) SOS yanıtını teşvik etmek için kullanılır, shiga toksin geni(stx) bakteri genomunda bulunan bir prophage genomunda bulunur28. Daha önce STEC suşları29,30, 31,32 tarafından üretilen Stx tiplerini ve alt tiplerini tespit etmek ve tanımlamak için antibiyotik indüksiyonu, MALDI-TOF-TOF-MS / MS ve yukarıdan aşağıyaproteomikanalizkullandık. Önceki çalışmada, STEC O113:H21 suşu RM7788, mitomycin-C ile desteklenmiş agar media üzerinde bir gecede kültürlendi. Bununla birlikte, m/z ~7816’da Stx2a’nın beklenen B-alt birliğini tespit etmek yerine, m/z ~ 7839’da farklı bir protein iyonu tespit edildi ve bilinmeyen işlev33plazmid kodlu varsayımsal protein olarak tanımlandı. Mevcut çalışmada, antibiyotik indüksiyonu kullanılarak bu suş tarafından üretilen iki plazmid kodlu AB-Im proteini, MALDI-TOF-TOF-MS/MS ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz, tam genom diziliminden (WGS) elde edilen siliko protein dizilerini işlemek ve taramak için geliştirilen bağımsız yazılım kullanılarak tespit ettik. Buna ek olarak, sıralı kesilmeyi içeren çeviri sonrası değişiklikler (PTM) olasılığı yazılıma dahil edildi. Bağışıklık proteinleri, aspartik asit etkisinin neden olduğu ve MS/MS-PSD tarafından tespit edilen PBC’den olgun protein iyonunun ve diziye özgü parça iyonlarının ölçülen kütlesinden bu yazılım kullanılarak tanımlanmıştır. Son olarak, bu suş DNA’ya zarar veren bir antibiyotiğe maruz kaldığında bu genlerin ekspresyonunu açıklayabilecek bir plazmid genomda AB / Im genlerinin yukarı akışında bir promotör tespit edildi. Bu çalışmanın bazı bölümleri National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo’da (17-20 Ağustos 2020)34.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokolle ilgili önemli noktalar
Mevcut protokolün birincil güçlü yönleri hızı, numune hazırlama basitliği ve kullanımı nispeten kolay olan, eğitilen ve bakımı olan bir cihazın kullanımıdır. Sıvı kromatografisi-ESI-HR-MS tarafından yapılan aşağıdan yukarıya ve yukarıdan aşağıya proteomik analiz her yerde bulunmasına ve MALDI-TOF-TOF tarafından yukarıdan aşağıya doğru birçok açıdan çok daha üstün olmasına rağmen, daha fazla zaman, emek ve uzmanlık gerekti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Protein Biomarker Seeker yazılımı, clifton.fagerquist@usda.gov’de Clifton K. Fagerquist ile iletişime geçerek (hiçbir ücret ödemeden) serbestçe kullanılabilir. Ars, USDA, CRIS hibesi: 2030-42000-051-00-D tarafından bu araştırmanın desteğini kabul etmek istiyoruz.
Materials
| 4000 Series Explorer software | AB Sciex | Version 3.5.3 | |
| 4800 Plus MALDI TOF/TOF Analyzer | AB Sciex | ||
| Acetonitrile Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | A996-1 | |
| BSL-2 biohazard cabinet | The Baker Company | SG403A-HE | |
| Cytochrome-C | Sigma | C2867-10MG | |
| Data Explorer software | AB Sciex | Version 4.9 | |
| Focus Protein Reduction-Alkylation kit | G-Biosciences | 786-231 | |
| GPMAW software | Lighthouse Data | Version 10.0 | |
| Incubator | VWR | 9120973 | |
| LB Agar | Invitrogen | 22700-025 | |
| Luria Broth | Invitrogen | 12795-027 | |
| Lysozyme | Sigma | L4919-1G | |
| Microcentrifuge Tubes, 2 mL, screw-cap, O-ring | Fisher Scientific | 02-681-343 | |
| MiniSpin Plus Centrifuge | Eppendorf | 22620207 | |
| Mitomycin-C (from streptomyces) | Sigma-Aldrich | M0440-5MG | |
| Myoglobin | Sigma | M5696-100MG | |
| Shaker MaxQ 420HP Model 420 | Thermo Scientific | Model 420 | |
| Sinapinic acid | Thermo Scientific | 1861580 | |
| Sterile 1 uL loops | Fisher Scientific | 22-363-595 | |
| Thioredoxin (E. coli, recombinant) | Sigma | T0910-1MG | |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | 299537-100G | |
| Water Optima LC/MS grade | Fisher Chemical | W6-4 |
References
- Fornelli, L., et al. Accurate sequence analysis of a monoclonal antibody by top-down and middle-down orbitrap mass spectrometry applying multiple ion activation techniques. Analytical Chemistry. 90 (14), 8421-8429 (2018).
- Fornelli, L., et al. Top-down proteomics: Where we are, where we are going. Journal of Proteomics. 175, 3-4 (2018).
- He, L., et al. Top-down proteomics-a near-future technique for clinical diagnosis. Annals of Translational Medicine. 8 (4), 136 (2020).
- Wu, Z., et al. MASH explorer: A universal software environment for top-down proteomics. Journal of Proteome Research. 19 (9), 3867-3876 (2020).
- Konermann, L., Metwally, H., Duez, Q., Peters, I. Charging and supercharging of proteins for mass spectrometry: recent insights into the mechanisms of electrospray ionization. Analyst. 144 (21), 6157-6171 (2019).
- Bourmaud, A., Gallien, S., Domon, B. Parallel reaction monitoring using quadrupole-Orbitrap mass spectrometer: Principle and applications. Proteomics. 16 (15-16), 2146-2159 (2016).
- Hart-Smith, G. A review of electron-capture and electron-transfer dissociation tandem mass spectrometry in polymer chemistry. Analitica Chimica Acta. 808, 44-55 (2014).
- Brodbelt, J. S., Morrison, L. J., Santos, I. Ultraviolet photodissociation mass spectrometry for analysis of biological molecules. Chemical Reviews. 120 (7), 3328-3380 (2020).
- Karas, M., Bachmann, D., Bahr, U., Hillenkamp, F. Matrix-assisted ultraviolet-laser desorption of nonvolatile compounds. International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes. 78, 53-68 (1987).
- Karas, M., Bachmann, D., Hillenkamp, F. Influence of the wavelength in high-irradiance ultraviolet-laser desorption mass-spectrometry of organic-molecules. Analytical Chemistry. 57 (14), 2935-2939 (1985).
- Tanaka, K., et al. Protein and polymer analyses up to m/z 100 000 by laser ionization time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2 (8), 151-153 (1988).
- Resemann, A., et al. Top-down de Novo protein sequencing of a 13.6 kDa camelid single heavy chain antibody by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight/time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 82 (8), 3283-3292 (2010).
- Suckau, D., Resemann, A. T3-sequencing: targeted characterization of the N- and C-termini of undigested proteins by mass spectrometry. Analytical Chemistry. 75 (21), 5817-5824 (2003).
- Mikhael, A., Jurcic, K., Fridgen, T. D., Delmas, M., Banoub, J. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight/time-of-flight tandem mass spectrometry (negative ion mode) of French Oak Lignin: A Novel Series of Lignin and Tricin Derivatives attached to Carbohydrate and Shikimic acid Moieties. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 34 (18), 8841 (2020).
- Demirev, P. A., Feldman, A. B., Kowalski, P., Lin, J. S. Top-down proteomics for rapid identification of intact microorganisms. Analytical Chemistry. 77 (22), 7455-7461 (2005).
- Fagerquist, C. K. Unlocking the proteomic information encoded in MALDI-TOF-MS data used for microbial identification and characterization. Expert Review of Proteomics. 14 (1), 97-107 (2017).
- Gu, C., Tsaprailis, G., Breci, L., Wysocki, V. H. Selective gas-phase cleavage at the peptide bond C-terminal to aspartic acid in fixed-charge derivatives of Asp-containing peptides. Analytical Chemistry. 72 (23), 5804-5813 (2000).
- Herrmann, K. A., Wysocki, V. H., Vorpagel, E. R. Computational investigation and hydrogen/deuterium exchange of the fixed charge derivative tris(2,4,6-trimethoxyphenyl) phosphonium: implications for the aspartic acid cleavage mechanism. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 16 (7), 1067-1080 (2005).
- Rozman, M. Aspartic acid side chain effect-experimental and theoretical insight. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 18 (1), 121-127 (2007).
- Yu, W., Vath, J. E., Huberty, M. C., Martin, S. A. Identification of the facile gas-phase cleavage of the Asp-Pro and Asp-Xxx peptide bonds in matrix-assisted laser desorption time-of-flight mass spectrometry. Analytical Chemistry. 65 (21), 3015-3023 (1993).
- Luethy, P. M., Johnson, J. K. The use of Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry (MALDI-TOF MS) for the identification of pathogens causing sepsis. The Journal of Applied Laboratory Medicine. 3 (4), 675-685 (2019).
- Knabl, L., Lass-Florl, C. Antifungal susceptibility testing in Candida species: current methods and promising new tools for shortening the turnaround time. Expert Review of Anti-Infective Therapy. 18 (8), 779-787 (2020).
- Gould, O., Ratcliffe, N., Krol, E., de Lacy Costello, B. Breath analysis for detection of viral infection, the current position of the field. Journal of Breath Research. 14 (4), 041001 (2020).
- Fagerquist, C. K., et al. Sub-speciating Campylobacter jejuni by proteomic analysis of its protein biomarkers and their post-translational modifications. Journal of Proteome Research. 5 (10), 2527-2538 (2006).
- Sandrin, T. R., Goldstein, J. E., Schumaker, S. MALDI TOF MS profiling of bacteria at the strain level: a review. Mass Spectrometry Reviews. 32 (3), 188-217 (2013).
- Christner, M., et al. Rapid MALDI-TOF mass spectrometry strain typing during a large outbreak of Shiga-Toxigenic Escherichia coli. PLoS One. 9 (7), 101924 (2014).
- Masaki, H., Ohta, T. Colicin E3 and its immunity genes. Journal of Molecular Biology. 182 (2), 217-227 (1985).
- Michel, B. After 30 years of study, the bacterial SOS response still surprises us. PLoS Biology. 3 (7), 255 (2005).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. Induction and identification of disulfide-intact and disulfide-reduced beta-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and top-down proteomics. Analyst. 136 (8), 1739-1746 (2011).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. Top-down proteomic identification of furin-cleaved alpha-subunit of Shiga toxin 2 from Escherichia coli O157:H7 using MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Journal of Biomedicine & Biotechnology. 2010, 123460 (2010).
- Fagerquist, C. K., et al. Top-down proteomic identification of Shiga toxin 2 subtypes from Shiga toxin-producing Escherichia coli by matrix-assisted laser desorption ionization-tandem time of flight mass spectrometry. Applied and Environmental Microbiology. 80 (9), 2928-2940 (2014).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J., Lee, B. G., Yambao, J. C., Quiñones, B. Clinically-relevant Shiga toxin 2 subtypes from environmental Shiga toxin-producing Escherichia coli identified by top-down/middle-down proteomics and DNA sequencing. Clinical Mass Spectrometry. 11, 27-36 (2019).
- Fagerquist, C. K., Lee, B. G., Zaragoza, W. J., Yambao, J. C., Quiñones, B. Software for top-down proteomic identification of a plasmid-borne factor (and other proteins) from genomically sequenced pathogenic bacteria using MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 438, 1-12 (2019).
- Fagerquist, C. K., Rojas, E. . ACS Fall 2020 Virtual Meeting & Expo. American Chemical Society, Virtual. , (2020).
- Fagerquist, C. K., Sultan, O. A new calibrant for matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight-time-of-flight post-source decay tandem mass spectrometry of non-digested proteins for top-down proteomic analysis. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 26 (10), 1241-1248 (2012).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Complementary b/y fragment ion pairs from post-source decay of metastable YahO for calibration of MALDI-TOF-TOF-MS/MS. International Journal of Mass Spectrometry. 415, 29-37 (2017).
- Quinones, B., Yambao, J. C., Lee, B. G. Draft genome sequences of Escherichia coli O113:H21 strains recovered from a major produce production region in California. Genome Announcements. 5 (44), 01203-01217 (2017).
- Harrison, A. G. The gas-phase basicities and proton affinities of amino acids and peptides. Mass Spectrometry Reviews. 16 (4), 201-217 (1997).
- Fagerquist, C. K. Polypeptide backbone cleavage on the C-terminal side of asparagine residues of metastable protein ions analyzed by MALDI-TOF-TOF-MS/MS and post-source decay. International Journal of Mass Spectrometry. 457, (2020).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. . Mass Spectrometry: Application to the Clinical Lab 2019 (MSACL 2019). , (2019).
- Fagerquist, C. K., Zaragoza, W. J. Bacteriophage cell lysis of Shiga toxin-producing Escherichia coli for top-down proteomic identification of Shiga toxins 1 & 2 using matrix-assisted laser desorption/ionization tandem time-of-flight mass spectrometry. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 30 (6), 671-680 (2016).
- Fagerquist, C. K., et al. Web-based software for rapid top-down proteomic identification of protein biomarkers, with implications for bacterial identification. Applied and Environmental Microbiology. 75 (13), 4341-4353 (2009).
- Fagerquist, C. K., et al. Rapid identification of protein biomarkers of Escherichia coli O157:H7 by matrix-assisted laser desorption ionization-time-of-flight-time-of-flight mass spectrometry and top-down proteomics. Analytical Chemistry. 82 (7), 2717-2725 (2010).
- Maus, A., Bisha, B., Fagerquist, C., Basile, F. Detection and identification of a protein biomarker in antibiotic-resistant Escherichia coli using intact protein LC offline MALDI-MS and MS/MS. Journal of Applied Microbiology. 128 (3), 697-709 (2020).
