Identification des protéines d’immunité antibactérienne chez Escherichia coli à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS et d’une analyse protéomique descendante

L’analyse et l’identification des protéines non digérées par spectrométrie de masse sont appelées analyse protéomique descendante^1,2,3,4. C’est maintenant une technique établie qui utilise l’ionisation par électropulvérisation (ESI)⁵ et les analyseurs de masse à haute résolution^6,ainsi que des techniques de dissociation sophistiquées, par exemple la dissociation par transfert d’électrons (ETD), la dissociation par capture d’électrons (ECD)^7,la photo-dissociation ultraviolette (UV-PD)^8,etc.

L’autre technique d’ionisation douce est la désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI)^9,10,11 qui a été moins largement utilisée pour l’analyse descendante, en partie parce qu’elle est principalement couplée à des analyseurs de masse à temps de vol (TOF), qui ont une résolution limitée par rapport aux autres analyseurs de masse. Malgré ces limitations, les instruments MALDI-TOF et MALDI-TOF-TOF ont été exploités pour l’analyse descendante rapide de protéines pures et de mélanges de protéines fractionnés et non fractionnés. Pour l’identification des protéines pures, la désintégration à la source (ISD) est une technique particulièrement utile car elle permet l’analyse par spectrométrie de masse (MS) des ions fragments ISD, ainsi que la spectrométrie de masse en tandem (MS /MS) de fragments d’ions protéiques fournissant un fragment spécifique à la séquence souvent à partir des N- et C-termini de la protéine cible, analogue au séquençage d’Edman^12,13 . Un inconvénient de l’approche ISD est que, comme dans le séquençage d’Edman, l’échantillon ne doit contenir qu’une seule protéine. Le seul besoin en protéines est dû à la nécessité d’attribuer sans ambiguïté des ions fragments à un ion précurseur. Si deux protéines ou plus sont présentes dans un échantillon, il peut être difficile d’attribuer quels ions fragments appartiennent à quels ions précurseurs.

L’attribution d’ions fragments/ions précurseurs peut être traitée à l’aide de MALDI-TOF-TOF-MS/MS. Comme pour toute expérience MS/MS classique, les ions précurseurs sont sélectionnés en masse/isolés avant la fragmentation, et les ions fragments détectés peuvent être attribués à un ion précurseur spécifique. Cependant, les techniques de dissociation disponibles pour cette approche se limitent principalement à la dissociation induite par collision à haute énergie (HE-CID)¹⁴ ou à la désintégration post-source (PSD)^15,16. HE-CID et PSD sont les plus efficaces pour fragmenter les peptides et les petites protéines, et la couverture de séquence peut, dans certains cas, être limitée. De plus, la DSIP entraîne un clivage de l’épine dorsale polypeptidique (CBP) principalement du côté C-terminal des résidus d’acide aspartique et glutamique par un phénomène appelé effet acide aspartique^17,18,19,20.

MALDI-TOF-MS a également trouvé une application de niche dans l’identification taxonomique des micro-organismes : bactéries^21,champignons²²et virus^23. Par exemple, les spectres MS sont utilisés pour identifier les bactéries inconnues par rapport à une bibliothèque de référence des spectres MS des bactéries connues à l’aide d’algorithmes de reconnaissance de formes à des fins de comparaison. Cette approche s’est avérée très efficace en raison de sa rapidité et de sa simplicité, bien qu’elle nécessite une culture nocturne de l’isolat. Les ions protéiques détectés par cette approche (généralement inférieurs à 20 kDa) comprennent une empreinte MS permettant une résolution taxonomique au niveau du genre et de l’espèce et dans certains cas au niveau de la sous-espèce²⁴ et de la souche^25,26. Cependant, il reste nécessaire non seulement de classer taxonomiquement les micro-organismes potentiellement pathogènes, mais aussi d’identifier des facteurs de virulence, des toxines et des facteurs de résistance aux antimicrobiens (RÉSISTANCE AUX ANTIMICROBIENS) spécifiques. Pour ce faire, la masse de peptides, de protéines ou de petites molécules est mesurée par la SEP, puis isolée et fragmentée par la SEP/SEP.

Les bactéries pathogènes portent souvent des morceaux circulaires d’ADN appelés plasmides. Les plasmides, ainsi que les prophages, sont un vecteur majeur de transfert horizontal de gènes entre les bactéries et sont responsables de la propagation rapide de la résistance aux antimicrobiens et d’autres facteurs de virulence à travers les bactéries. Les plasmides peuvent également être porteurs de gènes antibactériens (AB), par exemple la colicine et la bactériocine. Lorsque ces gènes sont exprimés et que les protéines sont sécrétées, ils agissent pour désactiver la machinerie de traduction des protéines des bactéries voisines occupant la même niche^{environnementale 27.} Cependant, ces enzymes bactéricides peuvent également poser un risque pour l’hôte qui les a produites. En conséquence, un gène est co-exprimé par l’hôte qui inhibe spécifiquement la fonction d’une enzyme AB et est appelé sa protéine d’immunité (Im).

Les antibiotiques endommageant l’ADN tels que la mitomycine-C et la ciprofloxacine sont souvent utilisés pour induire la réponse SOS chez E. coli producteur de toxine Shiga (STEC) dont le gène de la toxine Shiga(stx) se trouve dans un génome de prophage présent dans le génome bactérien^28. Nous avons déjà utilisé l’induction antibiotique, MALDI-TOF-TOF-MS/MS et l’analyse protéomique descendante pour détecter et identifier les types et sous-types Stx produits par les souches STEC^29,30,31,32. Dans les travaux précédents, la souche RM7788 de STEC O113:H21 a été cultivée pendant la nuit sur un milieu d’agar supplémenté en mitomycine-C. Cependant, au lieu de détecter la sous-unité B anticipée de Stx2a à m/z ~7816, un ion protéique différent a été détecté à m/z ~7839 et identifié comme une protéine hypothétique codée par plasmide de fonction inconnue³³. Dans les travaux actuels, nous avons identifié deux protéines AB-Im codées en plasmides produites par cette souche à l’aide de l’induction antibiotique, MALDI-TOF-TOF-MS/MS, et d’une analyse protéomique descendante à l’aide d’un logiciel autonome développé pour traiter et scanner des séquences de protéines in silico dérivées du séquençage du génome entier (WGS). En outre, la possibilité de modifications post-traduction (PTM) impliquant une troncature de séquence a été intégrée au logiciel. Les protéines immunitaires ont été identifiées à l’aide de ce logiciel à partir de la masse mesurée de l’ion protéique mature et des ions fragments spécifiques à la séquence de la CBP causés par l’effet de l’acide aspartique et détectés par MS/MS-PSD. Enfin, un promoteur a été identifié en amont des gènes AB/Im dans un génome plasmidique qui peut expliquer l’expression de ces gènes lorsque cette souche est exposée à un antibiotique endommageant l’ADN. Des parties de ce travail ont été présentées à la National American Chemical Society Fall 2020 Virtual Meeting & Expo (17-20 août 2020)³⁴.