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생화학

Fabricación interna sencilla de columnas capilares de ultra alto rendimiento con el enfoque FlashPack

Published: December 04, 2021
doi:
10.3791/62522
, ,
1Laboratory of Bioinformatics Methods in Combinatorial Chemistry and Biology, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,Russian Academy of Sciences, 2Department of Molecular Neuroimmune Signalling, Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry,Russian Academy of Sciences

Summary

Aquí presentamos un protocolo para el procedimiento optimizado de empaquetado de columna capilar FlashPack. La aplicación de un protocolo optimizado a una configuración común de bomba de presión de 100 bar permite un embalaje y una fabricación 10 veces más rápidos de columnas capilares largas y de ultra alto rendimiento.

Abstract

La cromatografía líquida capilar de ultra alto rendimiento (UHPLC) es actualmente un método de elección para el paso de separación de muestras en proteómica basada en LC-MS. Sin embargo, las columnas capilares son mucho menos robustas en comparación con sus contratipos de flujo más alto. Debido a la fácil contaminación y bloqueo, a menudo necesitan reemplazo. Eso los convierte en una parte marcadamente costosa del costo total del análisis LC-MS. El embalaje interno de columnas capilares UHPLC ahorra mucho dinero y permite la personalización. Sin embargo, el procedimiento de embalaje estándar en la bomba de presión de 100 bar funciona bien solo para columnas de HPLC, pero es demasiado lento para los sorbentes UHPLC. Aquí proporcionamos una descripción de un protocolo FlashPack optimizado aplicado a la misma configuración de bomba de presión de 100 bares. El método se basa en el envasado de purín de concentración de sorbente ultra alta y está desarrollado para la fabricación interna de columnas capilares UHPLC de longitud ilimitada en un tiempo razonable.

Introduction

La proteómica moderna se basa en la espectrometría de masas acoplada a cromatografía líquida con la cromatografía de nano flujo de ultra alto rendimiento (diámetro interno de la columna (ID)) de 50-150 μm que proporciona la mejor velocidad de análisis y sensibilidad1. Si bien hay numerosas columnas capilares UHPLC comerciales disponibles, su precio constituye una parte importante del costo de los consumibles, especialmente cuando se ejecutan múltiples proyectos diversos en el laboratorio y la contaminación de la columna específica del proyecto es un problema frecuente. Además, el empaquetado interno de columnas permite el uso de sorbentes personalizados específicos del experimento (como, por ejemplo, el sorbente polyCAT-A2)y las características de la columna que no están disponibles para comprar como una columna ya hecha.

Para hacer frente a eso, muchos laboratorios empacan columnas capilares internamente. Sin embargo, el procedimiento de empaquetado común con una bomba de presión de 100 bar (celda de inyección de presión)3 no es adecuado para el empaquetamiento de columna UHPLC debido a la alta contrapresión de sorbentes UHPLC de menos de 2 μm, lo que resulta en una reducción dramática de la tasa de empaquetamiento en comparación con los sorbentes HPLC de mayor tamaño. Mientras que las columnas UHPLC cortas todavía se pueden empaquetar muy lentamente, la fabricación de columnas UHPLC largas es físicamente imposible4.

El embalaje estándar de la columna capilar se realiza a presiones relativamente bajas, de hasta 100 bares, y con una concentración de lodo de sorbente muy baja. Por lo tanto, hay dos posibles direcciones para acelerar el proceso. Es posible aumentar la presión de embalaje5. Sin embargo, esto requiere un equipo especial y, prácticamente, la instalación de un nuevo método en el laboratorio. Otra forma es aumentar la concentración de purines sorbentes6. El embalaje de alta concentración de purines de sorbente se describe en combinación con una presión de embalaje ultra alta en una publicación anterior7. Sin embargo, a una presión de 100 bar, que se utiliza en la mayoría de las bombas de embalaje existentes, una mayor concentración de sorbente da como resultado una ralentización de la velocidad de envasado o un cese total del embalaje. Recientemente se demostró que el efecto se debía a la agrupación de sorbentes en la entrada de la columna, y se sugirió un truco simple de desestabilización de la cúpula sorbente martillando la entrada de la columna con una barra magnética dentro de un vial de sorbente4. El método resultante, denominado FlashPack, utiliza la misma configuración de empaquetado de bombas de presión de 100 bares. Al mismo tiempo, los cambios menores pero críticos en el procedimiento de embalaje permiten el envasado a partir de una concentración de purín de sorbente muy alta y la producción de columnas UHPLC muy largas (50 a 70 cm, y más) en menos de una hora, mientras que una columna corta se puede producir en minutos con la calidad de separación igual a las columnas comerciales de los mismos parámetros4. El enfoque FlashPack ya se utilizó con éxito en múltiples proyectos de proteómica para la preparación de columnas capilares de fase inversa (RP)8,9,10,11, 12,13,14 e interacción hidrófila (HILIC)2.

Aquí describimos en detalle, las modificaciones necesarias para la adaptación del enfoque FlashPack al procedimiento estándar de empaquetado de bombas a presión de 100 bar.

Protocol

El protocolo de embalaje consta de cinco pasos(Figura 1):1) Preparación de la estación de embalaje, 2) Preparación capilar, 3) Preparación de purines de sorbente, 4) Embalaje capilar en la bomba de presión y 5) Embalaje de columnas en el sistema HPLC, cortando hasta el tamaño y la instalación de conexión UHPLC. La optimización de FlashPack requiere que se realicen ajustes en las secciones 3 y 4 en comparación con el protocolo común. 1. Montaje de la estación de embalaje Prepare un tanque de gas lleno de nitrógeno, helio o argón equipado con un regulador de gas de una sola etapa con la presión de salida > 50 bares. La presión máxima está limitada por la compatibilidad de la bomba de presión. Conecte el regulador a la válvula de ventilación de la bomba de presión. Si la bomba de presión no está equipada con un agitador magnético integrado, coloque la bomba en un agitador magnético. Conecte un tubo de plástico ID estrecho (por ejemplo, 0,13 mm) a la salida de ventilación de la bomba de presión y colórelo en un recipiente con agua. 2. Preparación capilar Preparar un capilar fritado con una fritada de vidrio integrada formada a partir de Kasil y formamida15 o un capilar emisor tirado preparado por un arrancador láser16. El capilar se hace 10-15 cm más largo que la longitud de la columna prevista.NOTA: Consulte la Tabla 1 para la discusión de posibles problemas asociados con diferentes tamaños capilares y tipos de fritas. La Tabla 2 contiene un ejemplo de un programa de extracción láser P2000 para hacer capilares emisores tirados. Proteja un extremo del emisor tirado con una punta de pipeta de carga de gel cortada. Corte la punta para que quepa bien alrededor del capilar OD de 360 μm (se puede mover a lo largo del capilar, pero requiere un poco de esfuerzo para hacerlo). Deslice la punta de la pipeta cortada sobre el capilar desde la dirección del extremo frontal capilar y muévalo hasta el extremo emisor. Deslice hacia atrás la punta protectora cuando la columna esté pulverizando. Deslice la punta hacia adelante para que el emisor termine dentro de la punta cuando la columna no esté rociando (incluso cuando la columna esté bajo el flujo, pero aún no rociando). 3. Preparación de purines de sorbente Prepare un vial de sorbente caldo: Coloque ~ 50 mg de sorbente seco en un tubo de centrífuga de 1.5 ml. Aquí, Reprosil Pur C18 se utiliza como ejemplo. Añadir 1 ml de metanol al tubo sorbente. Para mezclarlo por completo, vórtice el tubo durante 10 s utilizando un mezclador de vórtice. Sonicar en un baño de sonicación durante 10 s. Deje que el sorbente se empape bien durante 20-30 min. Luego, vórtice y sonicarlo una vez más. Prepare un vial de sorbente que funcione. Use un vial de fondo cónico que quepa en la bomba.NOTA: Puede ser otro tubo centrífugo de 1,5 ml o cualquier otro vial dependiendo del diseño particular de la bomba de presión. Para este experimento, se utiliza un tubo cónico de tapón de rosca inferior cortado a la altura de la bomba de presión. Resuspenda el sorbente en el vial de sorbente de stock y transfiera 500 μL al vial de sorbente de trabajo con una barra magnética de 2 x 3 mm de tamaño. Agregue metanol hasta ~ 1 ml al vial de trabajo. Deje que el vial de trabajo se mantenga sobre la mesa durante 10 minutos para que el sorbente se asiente por gravedad. Si, después de la sedimentación, la capa de sorbente está por debajo de 4 mm, agregue más purín de sorbente de stock y espere a que el sorbente se asiente durante otros 10 minutos.NOTA: El vial de trabajo preparado está destinado a la preparación de múltiples columnas durante meses. Si el vial de sorbente de trabajo permanece sin agitar durante más de 2 h, debe ser vórtice durante 10 s, sonicado durante 10 s y asentado por gravedad. Rutinariamente, el sorbente se resuspende por la mañana antes de empacar. Luego, es bueno para empacar durante todo el día si no hay largas pausas entre el empaque de columna secuencial. Si el sorbente en el vial de trabajo se seca, agregue metanol y ejecute el procedimiento completo de preparación del sorbente como para el vial de sorbente de stock (pasos 3.2-3.5). 4. Embalaje capilar en una bomba de presión PRECAUCIÓN: Siempre use gafas protectoras cuando trabaje con la bomba de presión. No use guantes. Estos reducen severamente el sentido del tacto requerido para el manejo adecuado de capilares de pequeño diámetro y conducen a errores. Coloque el vial de sorbente en la bomba de presión y fije todas las tuercas herméticamente. Inicie la rotación a 60-100 rpm. Inserte el capilar emisor fritado o tirado en la bomba: empuje hasta el fondo del vial y luego levántelo 2-3 mm y fije la tuerca.NOTA: Aplique una fuerza mínima requerida para fijar el capilar para evitar daños capilares y ferrules. Lo mejor es apretar las manos. Si se utiliza una llave hexagonal, aplique el mínimo esfuerzo suficiente para apretar. Verifique si el capilar está correctamente fijado: debe ser imposible mover el capilar sacándolo a mano. Abra muy lentamente la válvula de la bomba de presión mientras mantiene el extremo abierto del capilar apuntando lejos de su cara. Observe los pasos iniciales del proceso de embalaje.NOTA: Inmediatamente después de la presurización, el sorbente llena el capilar y se vuelve no transparente durante toda la longitud. Tan pronto como el sorbente comienza a empacarse dentro del extremo distal, la contrapresión aumenta, el flujo se ralentiza y la suspensión de sorbente uniforme dentro del capilar se reforma en varios paquetes de sorbente separados por espacios libres de sorbente. El sorbente ya empaquetado es visible como una región de crecimiento continuo de color denso. Mantenga las regiones llenas de sorbente para que sean al menos el 70% de la longitud capilar con pequeños huecos libres de sorbente durante toda la duración del proceso de empaque. Hay varios problemas comunes a tener en cuenta durante el proceso de embalaje, que requieren un ajuste de configuración en vuelo para mantener una entrega eficiente de sorbente en el capilar.NOTA: En la Tabla 3se describen más detalles sobre el ajuste de la eficiencia de entrega del sorbente. Problema 1: Cuando el nuevo sorbente deja de entrar en el capilar mientras el sorbente que ya está dentro sigue moviéndose, siga los pasos a continuación.NOTA: Este es el problema más frecuente. En la mayoría de los casos, la entrada capilar se bloquea mediante grupos de sorbentes autoagregantes. Aplique los siguientes pasos uno por uno hasta que se restaure el flujo de sorbente y, a continuación, omita el resto de los pasos relacionados con el problema. Aumente la velocidad de rotación a 500 rpm e inmediatamente reduzca de nuevo a 60-100 rpm. Por lo general, restaura el flujo de sorbente. Compruebe que la velocidad de rotación sea de al menos 60 rpm durante el resto del proceso de embalaje. Si no ayuda, ventile brevemente la bomba de embalaje e inmediatamente presiónela de nuevo. Si no ayuda o el bloqueo vuelve a ocurrir, reposicione el capilar dentro de la capa sorbente. La ausencia del sorbente puede deberse a que el extremo abierto capilar está demasiado alto por encima de la barra magnética, por lo que el extremo de la columna no lo toca, o el capilar se adhiere al fondo del vial. Primero, ventile la bomba por completo, afloje la tuerca, empuje el capilar hacia el fondo y luego tire de él 2 mm hacia atrás. Arregla la tuerca. Si el bloqueo persiste, ventile el sistema, saque el vial de sorbente y el vórtice y sónico una vez más. Revise el extremo frontal capilar para detectar daños bajo el microscopio y corte ~ 5 mm del extremo frontal si es necesario. Problema 2: Cuando el sorbente llena solo una pequeña parte del capilar con regiones vacías largas, siga los pasos a continuación. Compruebe la velocidad de rotación. Si la rotación es demasiado lenta, la rotura de la cúpula no es lo suficientemente eficiente. Aumente la velocidad de rotación a ~ 150 rpm. Si la rotación es demasiado rápida, el sorbente se resuspende en el mayor volumen del vial y la concentración local de sorbente alrededor de la entrada de la columna es baja. Reduzca la velocidad de rotación a 60-100 RPM. Compruebe el nivel de sorbente. El mismo problema con poco sorbente dentro del capilar se observa cuando no hay suficiente sorbente en el vial. Cuando el sorbente se use, llene el vial con el nuevo sorbente para mantener la capa de sorbente no menos de 4 mm de altura después de la sedimentación inducida por la gravedad. Siga empacando la columna hasta que se logre la longitud de la columna objetivo más 5-7 cm. Detenga la rotación y despresurice muy lentamente la bomba. Abra un poco la válvula de la bomba y espere a que la burbuja estalle dentro de la botella de agua para disminuir. Luego, abra la válvula un poco más ancha y espere nuevamente a que la burbuja estalle para disminuir la velocidad. Libere la presión en incrementos hasta que no salga gas de la válvula.NOTA: No abra la válvula de una sola vez, ya que provocará burbujeos dentro del capilar y el sorbente volverá al vial. Si eso sucede, presione la bomba hacia atrás y espere a que la columna se empaquete nuevamente. Cuando el gas deje de salir de la válvula de ventilación, saque el capilar empaquetado de la bomba de presión.NOTA: No deje que la columna se seque. Si no se conecta al sistema HPLC inmediatamente para un embalaje adicional, almacene el capilar envasado sumergiéndolo entero en una solución de EtOH al 10%. Se puede utilizar un recipiente de almacenamiento de alimentos de polipropileno hermético al líquido para el almacenamiento capilar. Las columnas de HPLC desconectadas se almacenan de la misma manera. Si no se planea empacar más, saque el vial de sorbente de la bomba y ciérrelo herméticamente. Guárdalo para un embalaje de columna adicional. 5. Embalaje en la columna HPLC Conecte el capilar empaquetado al sistema HPLC a través de una conexión HPLC. Comience el flujo al 95% del disolvente B (80 o 100% de acetonitrilo, 0,1% de ácido fórmico (FA)) apuntando a una presión de 250-300 bar. Para capilares empaquetados de 40 cm, utilice el caudal de 200-300 nL/min.NOTA: El caudal de embalaje es de 200 nL/min para una columna de 40-50 cm con ID de 100 μm embalado con 2 μm de sorbente. Algunos otros tamaños de columna se enumeran en la Tabla 4. Los caudales para otras longitudes de columna e ID se estiman a partir de la proporcionalidad directa entre la contrapresión y la longitud de la columna y la sección transversal. El caudal exacto se ajusta a la longitud real empaquetada, que es por defecto más larga que la longitud de columna de destino. También tenga en cuenta que la presión de 300 bar se dirige al límite de presión física de la conexión HPLC. Para conexiones de mayor presión, se deben utilizar caudales más altos hasta el límite de presión de conexión para un embalaje más rápido. Esté atento a que el sorbente suelto dentro del capilar se empaquete y se agregue a la longitud total del paquete. Sin detener el flujo, sumerja el cuerpo de la columna dos veces en el baño de sonicación.NOTA: No sumerja los extremos de la columna y las conexiones capilares, solo una parte del cuerpo de la columna. El paso de sonicación ayuda a mejorar la reproducibilidad de la columna, especialmente para columnas extremadamente largas >50 cm de largo (datos no publicados); sin embargo, agrega una posibilidad aleatoria de romper la fritura sorbente autoensamblable dentro del extremo emisor del capilar del emisor tirado y bloquear la columna por completo. Si bien la sonicación se puede aplicar universalmente a cualquier columna fritada con vidrio, sugerimos sonicar las columnas de emisor tiradas solo para la longitud de la columna > 50 cm. Cuando el lecho sorbente deje de encogerse, sumerja el cuerpo de la columna en el baño de sonicación dos veces más sin detener el flujo. Ejecute la columna durante 10 minutos adicionales a 300 bares. Detenga el flujo, espere a que la presión caiga por debajo de tres bares y desconecte la columna. Inspeccione visualmente la columna para la falta de huecos y decoloraciones. Si se encuentra alguno, la sonicación bajo el flujo se puede repetir. Para experimentos críticos, considere hacer una nueva columna. Corte la columna a la longitud deseada.NOTA: El corte correctamente realizado es un requisito previo para la eficiencia de la columna. Haga una muesca en el recubrimiento de poliimida con el escriba, agriete parcialmente el capilar y separe dos piezas. Pule el extremo frontal de la columna en una oblea de cerámica o con una película de lapping. Vuelva a conectar la columna al sistema LC mediante una conexión UHPLC. Comience el caudal de trabajo al 2% B dependiendo del ID de la columna de acuerdo con la Tabla 4. Espere a que la presión se equilibre y verifique la contrapresión de la columna.NOTA: El caudal de trabajo se ajusta de acuerdo con los parámetros de la columna. Por ejemplo, una columna de identificación de 100 μm de largo de 30 cm se ejecuta a 500 nL / min. Asegúrese de que la contrapresión está dentro del 5% del valor esperado (consulte la Tabla 5), Esto confirma que la columna está empaquetada correctamente y está lista para usar.NOTA: La contrapresión de columna es la presión total en el canal de gradiente del sistema HPLC con la columna conectada menos la contrapresión de los capilares antes de la columna. Al mismo tiempo, los valores de la Tabla 5 son arbitrarios (dan una escala arbitraria de qué esperar). La similitud intra-laboratorio de la contrapresión de columna a columna es un indicador más importante de que todo funciona correctamente. La contrapresión absoluta real depende de muchos parámetros, como el tamaño y las características del sorbente, la identificación capilar, el fabricante y el lote, la forma del extremo del emisor tirado o la densidad y longitud de la frita de vidrio, las características del disolvente y la temperatura ambiente en la habitación, etc. Si la contrapresión es demasiado alta, consulte la Tabla 1 para posibles problemas.

Representative Results

El enfoque de FlashPack se basa en la configuración de embalaje estándar y sigue la misma tubería de embalaje. El embalaje se realiza en capilares emisores estándar fritados o tirados. La optimización principal radica en la concentración de purines de sorbente: el método estándar es incompatible con una suspensión de sorbente de alta concentración utilizada en FlashPack. El resultado es un método de producción rápido para columnas UHPLC largas, por ejemplo, una columna empaquetada para 50 cm de longitud con 1,9 μm de sorbente en menos de 1 h (Figura 2). Para demostrar la aplicación del enfoque FlashPack, se preparó una columna capilar ID de 30 cm y 100 μm (Tabla 6). El embalaje del sorbente ReprosilPur C18 de 1,9 μm se realizó a 60 bares en un capilar emisor tirado por ID de 50 cm de largo y 100 μm, preparado por un arrancador láser P2000. El capilar se empaquetó a ~ 40 cm en 40 minutos con un poco más de sorbente suelto dentro del capilar. El capilar empaquetado se conectó a un sistema HPLC y se ejecutó a 300 nL/ min con disolvente B (80% acetonitrilo, 0,1% FA). Después de dos rondas de sonicación de 5 s, la longitud final del paquete fue de 43 cm. La columna se desconectó, se cortó a 30 cm y se conectó al sistema HPLC mediante una conexión UHPLC. Utilizamos rutinariamente una férula de tuerca PEEK sin mangas de 360 μm y una unión de acero inoxidable de 360 μm. Esta combinación aguanta al menos hasta 700 barras si se aprieta fuertemente. La columna fabricada tiene una contrapresión de 520 bares al 2% de disolvente B a 500 nL/min, lo que es consistente con el rango de valores esperados (Tabla 5). Como demostración de la eficiencia de la columna, utilizamos la columna fabricada de 30 cm para separar 50 fmol de una digestión tríptica de la proteína del citocromo C en un gradiente de 15 minutos del 2% al 50% B. Los cromatogramas iónicos extraídos mostraron que los picos son altamente simétricos con un cola mínimo. El FWHM promedio fue de alrededor de 3 s(Figura 3). Tabla 1: Solución de problemas para la alta contrapresión de trabajo de la columna. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 2: Programa de extracción láser P2000/F. Programa de extracción láser P2000/F para la preparación de capilares emisores tirados a partir de capilares recubiertos de poliimida de sílice fundido de 360 μm OD 100 μm ID sin recubrimiento interno a temperatura ambiente 23-25 °C. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 3: Problemas de embalaje específicos de FlashPack y puntos de control para controlar durante el proceso de embalaje. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 4: Caudales de embalaje y trabajo ejemplares para diferentes IDs de columna y longitud. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Tabla 5: Contrapresión esperada para una columna empaquetada consorbentes esféricos de 2 μ m y que funciona a la velocidad de flujo de trabajo (de acuerdo con el ID de columna) en el sistema de solvente RP en RT. Haga clic aquí para descargar esta Tabla. Tabla 6: Embalaje ejemplar de columna UHPLC de 30 cm. Haga clic aquí para descargar esta tabla. Figura 1: Esquema de empaquetamiento de columna capilar. Las etapas 1 a 3 son preparatorias, seguidas por el empaquetado de bombas a presión y terminadas por el empaquetamiento de HPLC. Las etapas 3 y 4 se modifican para el protocolo FlashPack ultra eficiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 2: Velocidad de embalaje para un ID capilar fritizado de 100 μm con ReprosilPur C18 AQ 1.9 μm a 100 bares en metanol. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Figura 3: Cromatogramas iónicos extraídos de péptidos trápticos del citocromo C. Se extrajeron cromatogramas iónicos de péptidos trípticos del citocromo C después de la separación de 50 fmol en columna capilar emisora tirada de 30 cm de largo 100 mm ID empaquetada con ReprosilPur C18 AQ 1,9 μm en un gradiente de tampón B (80% acetonitrilo, 0,1% FA) y en tampón A (2% acetonitrilo, 0,1% FA) de 2% a 40% B en 15 min a 500 nL/min en RT. La detección se realizó mediante un espectrómetro de masas. Las intensidades absolutas y los rangos m/z extraídos para cada péptido se muestran a la derecha de los espectros. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

El embalaje interno de columnas capilares es muy popular en grandes laboratorios que trabajan en múltiples proyectos independientes. Sin embargo, un método de empaquetamiento común a partir de una suspensión sorbente de baja concentración tiene limitaciones importantes en la velocidad y es incapaz de producir columnas UHPLC largas.

FlashPack es una modificación del procedimiento de embalaje estándar que hace posible el envasado a partir de una concentración de sorbente muy alta. La base teórica del método radica en la desestabilización continua de la cúpula sorbente en la entrada de la columna durante toda la duración del embalaje. Esto último se logra técnicamente mediante la entrada de la columna que se golpea continuamente con una barra magnética. El método de desestabilización de la cúpula se desarrolla intencionalmente para tener la configuración de empaque completamente similar al proceso de empaque común, pero el truco de FlashPack radica en los detalles de la preparación de la suspensión de sorbente, el posicionamiento capilar y el uso de la barra magnética durante el proceso de empaque.

La suspensión de sorbente se prepara como una capa de sorbente de sedimentos en un gran volumen de disolvente. Es interesante que el embalaje a base de bombas de presión no requiere las mismas condiciones de embalaje para columna a columna. En FlashPack, nunca sabemos la concentración exacta de lodo de sorbente alrededor de la entrada de la columna. Es imposible medir y controlar con exactitud, ya que también cambia durante el proceso de embalaje. Sin embargo, las columnas finales siguen siendo muy reproducibles4 independientemente de cómo se logró el embalaje.

La base para el embalaje rápido radica en la eficiente desestabilización de la cúpula sorbente. Por esta razón, es importante controlar el sorbente que ingresa al capilar y mantener las condiciones óptimas de desestabilización de la cúpula durante toda la duración del embalaje. Hay varios problemas posibles que podrían impedir la entrega eficiente de sorbentes. Algunos ejemplos de estos son la resuspensión de la capa de sorbente por rotación rápida de la barra magnética, la desestabilización ineficiente de la cúpula debido a la posición capilar relativa incorrecta a la barra magnética o la rotación demasiado lenta de la barra magnética. Las cuestiones en sí mismas y la forma en que deben abordarse se examinan en detalle en la sección de protocolo.

Después de empaquetar la columna, el parámetro de columna principal para verificar es la contrapresión de columna. Los valores de presión enumerados en la Tabla 5 proporcionan un punto de referencia a lo que se espera para uno de los populares sorbentes de tamaño de perla sub 2 μm:ReproSil PUR C18 AQ (1,9 μm). Al mismo tiempo, la fritura o un emisor demasiado estrecho pueden agregar contrapresión adicional y uno debe monitorear constantemente para eso. Si el embalaje se realiza en un emisor tirado, aún sugerimos medir la contrapresión de columna esperada para el sorbente particular en uso empaquetando primero los capilares fritados, y luego para ver si la fritada autoensamblada agrega demasiado. Para cualquier problema de alta presión, utilice las directrices proporcionadas en la Tabla 1 para identificar el problema.

En nuestra experiencia, una columna empaquetada sin decoloraciones, huecos y con la contrapresión adecuada funciona en el 100% de los casos y da una calidad de separación cercana a lo que se puede esperar de la longitud de la columna y las características del sorbente. No se garantiza que una columna con decoloraciones funcione correctamente, pero aún puede dar resultados satisfactorios.

La mayoría de las veces, si hay algún problema con la calidad de la separación, no provienen de la columna en sí, sino de otras partes del sistema de separación, a saber, bombas, disolventes o conexiones. Especialmente potencialmente dañina es cualquier conexión posterior a la columna. La mala conexión con un volumen muerto entre el emisor y la columna fritada conduce a un gran ensanchamiento y cola de picos debido a los caudales muy bajos en la cromatografía capilar.

Un problema más importante específico del enfoque FlashPack es que utiliza muchos sorbentes caros en un vial de lodo de sorbente que funciona. Recuerde que la suspensión de sorbente en FlashPack está diseñada para uso múltiple. Cuida el sorbente. Evite la agitación innecesaria de la barra magnética para reducir la molienda del sorbente: recuerde detener la rotación tan pronto como termine el embalaje. Y no deje el vial de sorbente abierto en la bomba de presión para evitar el secado del sorbente. Aunque el sorbente todavía se puede usar después de eso, lleva tiempo rehacer la suspensión del sorbente.

El método funciona igualmente bien tanto para los capilares fritados como para los capilares emisores tirados. El principio FlashPack aumenta la velocidad de empaquetamiento para los ID capilares de 20 a 250 μm (no se probaron los más pequeños y los más grandes). También es aplicable a todos los sorbentes, tanto total como superficialmente porosos, que podríamos probar (lo que refleja que la formación de cúpula sorbente en alta concentración de purines de sorbente no se limita específicamente a los sorbentes RP). Además, los parámetros del disolvente afectan claramente al embalaje según sus características físicas y químicas. Por ejemplo, una acetona menos viscosa da una tasa de empaquetamiento aún mayor que el metanol a la misma presión de empaque. Sin embargo, también es menos polar que el metanol y reduce las partículas sorbentes que se adhieren entre sí. El efecto por sí solo evita la formación de cúpula sorbente al comienzo del empaque cuando el caudal aún es alto. Sin embargo, la reducción en la interacción de partículas sorbentes también conduce a una formación de fritas autoensambladas menos confiable y un bloqueo más frecuente del extremo tirado durante el embalaje. Por lo tanto, mientras que la acetona es mejor para el empaquetamiento de capilares fritados, es menos adecuada para capilares emisores tirados, con el metanol como disolvente de lodo siendo más lento pero adecuado para ambos tipos de terminación. El empaquetamiento de hexano o diclorometano (DCM) son casos extremos de cambio a acetona de metanol: son aún menos polares, por lo que evitan la formación de cúpula sorbente por completo, sin embargo, no son aptos para el empaque del emisor tirado en absoluto. Además, se observó que la polaridad DCM extremadamente baja conduce a partículas sorbentes que se adhieren a la pared capilar interna y hacen una capa gruesa sobre ella. El espesor de la capa crece gradualmente y se forman bloques locales aleatorios, lo que resulta en la columna empaquetada en varias partes separadas por regiones sin sorbente. Tal efecto se observó para el sorbente Aeris del péptido C18.

Otro problema observado fue que el sorbente YMC Triart C18 no se suspendió en metanol correctamente, sino que formó algún tipo de escamas. Sin embargo, eso no impide que se empaquete con el FlashPack y dé una eficiencia de separación muy decente (datos no publicados). Por lo tanto, aunque no era óptimo para algunos casos, el metanol era el disolvente más universal para trabajar para todos los sorbentes y columnas probados. Es necesario mencionar que aún no analizamos cómo los diferentes solventes de lodo afectan la eficiencia de separación de columnas. Al mismo tiempo, la eficiencia de las columnas empaquetadas a partir de metanol ya es completamente igual a las columnas comerciales para los mismos sorbentes4.

FlashPack no es el único enfoque existente para mejorar la tasa de empaquetado de las columnas UHPLC. El envasado rápido a partir de una alta concentración de purines de sorbente también es posible con el uso de envases de presión ultra alta7. La ventaja de FlashPack es que es mucho más simple, ya que no requiere bombas especiales de presión ultra alta y bombas de presión para la entrega de sorbentes y conexiones capilares. Al mismo tiempo, se demostró que las columnas empaquetadas a presiones extremas pueden tener una eficiencia de separación superior a las columnas empaquetadas a menor presión17. Y aunque FlashPack produce columnas idénticas a las comerciales utilizadas en la comparación4,para las cuales no conocemos el método de empaquetado, aún no se ha probado cómo las columnas FlashPack se comparan con las columnas empaquetadas a ultra alta presión.

En resumen, el método FlashPack descrito se puede adaptar fácilmente al protocolo de embalaje existente en el laboratorio con algunos ajustes realizados en el protocolo, mientras que la configuración permanece completamente igual. Acelera el embalaje de la columna capilar HPLC a minutos de tiempo y permite la producción de columnas capilares UHP largas, lo que es claramente imposible con el procedimiento de embalaje estándar. La economía general en tiempo y dinero para el laboratorio mediante la aplicación del enfoque FlashPack se puede contar en decenas de miles de euros por año. Además, la capacidad de producir columnas capilares UHP localmente abre las posibilidades de personalización de experimentos imposibles con los productos comerciales disponibles.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

El trabajo fue apoyado por la subvención de RSF 20-14-00121. Los autores agradecen a P. V. Shliaha (Memorial Sloan Kettering Cancer Center) por sus fructíferas discusiones.

Materials

Acetonitrile with 0.1% (v/v) Formic acid Merck 1.59002
centrifuge tube 1.5 mL Eppendorf
Ceramic Scoring Wafer Restek 20116 any ceramic wafer is suitable for capillary polishing
Diamond-chip bladed scribe NewObjective Diamond-chip bladed scribe recommended for capillary cutting
fused silica capillary 100 mm ID 375 mm OD CM Scientific TSP100375
GELoader tips Eppendorf 30001222
HPLC system ThermoScientific Ultimate3000 RSLCnano
laser puller Sutter P2000/F
magnet bar 2×5 mm Merck Z283819
MeOH Merck 1.06018
microspatula Merck Z193216
PEEK ferrule 360 mm VICI JR-C360NFPK use to connect the column to UPLC union
pipette tip, 1000 uL Merck Z740095
pipette, 1000 uL Gilson Pipetman L P1000L
pressure bomb NextAdvance PC-77 MAG
regulator GCE Jetcontrol 600 200/103
Reprosil Pur C18 AQ 120 1.9 mm Dr. Maisch r13.aq.0001
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 0.5 mL Merck AXYST050SS
Screw cap tubes without caps, conical bottom, self-standing, 1.5 mL Merck AXYST150SS
Screw caps with O-rings Merck AXYSCOC
sonication bath Elma Elmasonic S30 H
union HPLC VICI JR-C360RU1PK6 HPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
union UPLC VICI JR-C360RU1FS6 UPLC connection from 1/16 OD HPLC capillary to 360 um capillary column
vortex BioSan V-1plus
Water with 0.1% (v/v) Formic acid Merck 1.59013
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References

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In-house Capillary Column ManufacturingFlashPack ApproachUltra-high Performance Capillary Liquid ChromatographyLC-MS ProteomicsPeptide SeparationCapillary ColumnsSorbent PackingHigh Sorbent Slurry ConcentrationPressure Bomb PackingMagnet BarPacking RateUltra-high Performance SorbentsLong ColumnsColumn Preparation ProcedurePacking StationNitrogen Gas TankPressure BombMagnetic StirrerPEEK Capillary

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Kovalchuk, S. I., Ziganshin, R., Shelukhina, I. Simple In-House Ultra-High Performance Capillary Column Manufacturing with the FlashPack Approach. J. Vis. Exp. (178), e62522, doi:10.3791/62522 (2021).
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