Detectie van SARS-CoV-2 Receptor-Binding Domain Antibody met behulp van een HiBiT-gebaseerde Bioreporter
Summary
Het geschetste protocol beschrijft de procedure voor de productie van het HiBiT-receptor-bindende domeineiwitcomplex en de toepassing ervan voor snelle en gevoelige detectie van SARS-CoV-2-antilichamen.
Abstract
De opkomst van de COVID-19-pandemie heeft de behoefte aan betere serologische detectiemethoden vergroot om de epidemiologische impact van ernstig acuut respiratoir syndroom coronavirus 2 (SARS-CoV-2) te bepalen. Het toenemende aantal SARS-CoV-2-infecties verhoogt de behoefte aan betere antilichaamdetectietests. De huidige antilichaamdetectiemethoden brengen de gevoeligheid voor snelheid in gevaar of zijn gevoelig maar tijdrovend. Een groot deel van de SARS-CoV-2-neutraliserende antilichamen richt zich op het receptorbindende domein (RBD), een van de primaire immunogene compartimenten van SARS-CoV-2. We hebben onlangs een zeer gevoelige, bioluminescente RBD (NanoLuc HiBiT-RBD) ontworpen en ontwikkeld om SARS-CoV-2-antilichamen te detecteren. De volgende tekst beschrijft de procedure om het HiBiT-RBD-complex te produceren en een snelle test om de aanwezigheid van RBD-gerichte antilichamen met behulp van deze tool te evalueren. Vanwege de duurzaamheid van het HiBiT-RBD-eiwitproduct over een breed temperatuurbereik en de kortere experimentele procedure die binnen 1 uur kan worden voltooid, kan het protocol worden beschouwd als een efficiënter alternatief om SARS-CoV-2-antilichamen in serummonsters van patiënten te detecteren.
Introduction
De recente opkomst van een nieuw coronavirus, SARS-CoV21, heeft op 30 maart 20212 meer dan 2.800.000 doden en 128 miljoen besmettingen veroorzaakt. Vanwege het ontbreken van een betrouwbare en gevestigde behandelingsprocedure voor sars-cov-2 klinische therapieën, zijn er veel inspanningen geleverd om verdere virale overdracht te beperken en nog belangrijker, om een effectieve en robuuste behandeling of een vaccin te ontwikkelen3. Tot op heden zijn er meer dan 50 COVID-19-vaccinkandidaten in onderzoeken gerapporteerd door de Wereldgezondheidsorganisatie4. Detectie van antilichamen tegen SARS-CoV-2 is van het grootste belang om de stabiliteit op lange termijn van de humorale respons bij toediening van het vaccin en bij herstelde patiënten van COVID-195 te bepalen. Sommige studies hebben aangetoond dat er een mogelijkheid is dat herstelde SARS-CoV-2-patiënten de meeste RBD-bindende antilichamen verliezen na 1 jaar5,6,7,8,9. Verder onderzoek is nodig om blijvende immuniteit beter te begrijpen, en meer gevoelige antilichaamdetectieplatforms kunnen dergelijk werk helpen bevorderen. Meldingen van aanhoudende immuniteit van milde SARS-CoV-2-infecties, die langdurige antilichaamresponsen suggereren, is ook een interessant en de moeite waard studiegebied. Een snelle en nauwkeurige detectiemethode is essentieel voor het monitoren van antilichamen in de sera van individuen om meer informatie te geven over immuniteit in de populatie.
Net als andere coronavirussen gebruikt SARS-CoV-2 uitstekende spike glycoproteïne om te binden aan angiotensine-converterend enzym-2 (ACE2) om een cascade van gebeurtenissen te initiëren die leiden tot de fusie van de virale en celmembranen6,7. Verschillende studies hebben onlangs aangetoond dat de RBD van het Spike-eiwit een cruciale rol speelt bij het opwekken van een krachtige en specifieke antilichaamrespons tegen SARS-CoV28,9,10,11. In het bijzonder zijn correlaties waargenomen door Premkumar et al. tussen de titer van RBD-bindend antilichaam en SARS-CoV-2 neutralisatiepotentie van het plasma van patiënten consistent met RBD als een immunogeen compartiment van de virusstructuur9. Met dat in gedachten zijn veel diagnostische tests die beschikbaar zijn voor SARS-CoV-2-antilichaamdetectie tijd- en kostenintensief, vereisen ze een langdurige procedure van incubatie en wassen (enzyme-linked immunosorbent assay [ELISA]), of missen ze gevoeligheid en nauwkeurigheid (laterale flow immunoassay [LFIA])12. Daarom zou een kwantitatieve en snelle complementaire serologische methode van covid-19-afgeleide antilichaamdetectie met hoge gevoeligheid, snelle respons en relatief lage kosten voldoen aan de behoefte aan een betrouwbare serologische test voor SARS-CoV-2 epidemiologische surveillance.
Gezamenlijk hebben de beperkingen van de huidige serologische assays geleid tot het onderzoek van het bioluminescente rapportagesysteem als een potentieel diagnostisch middel in toekomstige serosurveys. Bioluminescentie is een natuurlijk voorkomende enzym/substraatreactie, met lichtemissie. Nanoluc luciferase is het kleinste (19 kDa), maar toch het helderste systeem in vergelijking met Renilla en firefly luciferase (respectievelijk 36 kDa en 61 kDa)13,14. Verder heeft Nanoluc de hoogste signaal/ruisverhouding en stabiliteit van de eerder genoemde systemen. De hoge signaalintensiteit van Nanoluc ondersteunt de detectie van zelfs zeer lage hoeveelheden reporterfusies15. Nanoluc Binary Technology (NanoBiT) is een gesplitste versie van het Nanoluc-systeem, dat bestaat uit twee segmenten: kleine BiT (11 aminozuren; SmBiT) en grote BiT (LgBiT) met relatief lage affiniteitsinteracties (KD = 190 μM ) om een luminescerend complex te vormen16. NanoBiT wordt op grote schaal gebruikt in verschillende studies met betrekking tot de identificatie van eiwit-eiwitinteracties15,17,18,19 en cellulaire signaalroutes11,20,21.
Onlangs werd een ander klein peptide met een duidelijk hogere affiniteit voor LgBiT (KD = 0,7 nM) geïntroduceerd, namelijk het HiBiT Nano-Glo-systeem, in plaats van SmBiT. De hoge affiniteit en het sterke signaal van de Nano-Glo “add-mix-read” assay maakt HiBiT een geschikte, kwantitatieve, luminescerende peptide tag. In deze benadering wordt de HiBiT-tag toegevoegd aan het doeleiwit door een constructie te ontwikkelen die minimale structurele interferentie oplegt. HiBiT-eiwitfusie zou actief binden aan de LgBiT-tegenhanger, waardoor een zeer actief luciferase-enzym wordt geproduceerd om detecteerbare bioluminescentie te genereren in aanwezigheid van detectiereagentia (figuur 1). Op dezelfde manier ontwikkelden we een HiBiT Nano-Glo-gebaseerd systeem om de neutraliserende antilichaamtiter gemakkelijk te meten in de sera van SARS-CoV-2 herstelde individuen en ontwikkelden we onlangs een HiBiT-tagged SARS-CoV-2 RBD. Dit artikel beschrijft het protocol voor het produceren van de HiBiT-RBD bioreporter met behulp van standaard laboratoriumprocedures en apparatuur, en laat zien hoe deze bioreporter kan worden gebruikt in een snelle en efficiënte test om SARS-CoV-2 RBD-gerichte antilichamen te detecteren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het toenemende aantal mensen dat besmet is met de SARS-CoV-2 en de voortdurende inspanning voor wereldwijde vaccinatie vereist gevoelige en snelle serologische tests die kunnen worden gebruikt in grootschalige serosurveys. Recent onderzoek toont aan dat gesplitste op nanoluciferase gebaseerde bioreporters kunnen worden gebruikt om dergelijke testen te ontwikkelen. We hebben onlangs de HiBiT-RBD bioreporter ontwikkeld om een test te ontwerpen die kan worden gebruikt om SARS-CoV-2-specifieke antilichamen in het serum van d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We waarderen en bedanken de technische assistentie van Xiaohong He, Ricardo Marius, Julia Petryk, Bradley Austin en Christiano Tanese De Souza. We bedanken ook Mina Ghahremani voor grafisch ontwerp. We willen ook alle personen bedanken die hebben deelgenomen en hun bloedmonsters hebben gedoneerd voor deze studie. DWC wordt gedeeltelijk ondersteund door uOttawa Faculteit en Afdeling Geneeskunde.
Materials
| 5x Passive Lysis Buffer | Promega | E194A | 30 mL |
| Bio-Plex Handheld Magnetic Washer | Bio-Rad | 171020100 | |
| DMEM | Sigma | D6429-500ml | |
| Dual-Glo luciferase Assay System | Promega | E2940 | 100 mL kit |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma | F1051 | |
| HiBiT-RBD Plasmid | gacggatcgggagatctcccgatcccctatggt gcactctcagtacaatctgctctgatgccgcata gttaagccagtatctgctccctgcttgtgtgttgg aggtcgctgagtagtgcgcgagcaaaattta agctacaacaaggcaaggcttgaccgacaa ttgcatgaagaatctgcttagggttaggcgttttg cgctgcttcgcgatgtacgggccagatatacgc gttgacattgattattgactagttattaatagt aatcaattacggggtcattagttcatagcccat atatggagttccgcgttacataacttacggtaa atggcccgcctggctgaccgcccaacgaccc ccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttccc atagtaacgccaatagggactttccattgacgtc aatgggtggagtatttacggtaaactgcccact tggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagta cgccccctattgacgtcaatgacggtaaatgg cccgcctggcattatgcccagtacatgaccttat gggactttcctacttggcagtacatctacgtat tagtcatcgctattaccatggtgatgcggtttt ggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttg actcacggggatttccaagtctccaccccattg acgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatc aacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccg ccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgta cggtgggaggtctatataagcagagctctctgg ctaactagagaacccactgcttactggcttatcg aaattaatacgactcactatagggagacccaa gctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccga gctcggatccgccaccATGGAGACAGA CACACTCCTGCTATGGGTACTGC TGCTCTGGGTTCCAGGTTCCAC TGGTGACtctggctctagcggctctggctct agcggcggcATGGTGAGCGGCTG GCGGCTGTTCAAGAAGATTAGC tctagcggcGACTACAAGGACC ACGACGGTGACTACAAGGACCA CGACATCGACTACAAGGACGAC GACGACAAGggcagcggctccggca gcagcggaggaggaggctctggaggagga ggctctagcggcggcaacatcacaaatctgtg cccattcggcgaggtgtttaacgccaccagat ttgccagcgtgtatgcctggaaccggaagaga atctctaattgcgtggccgactatagcgtgct gtacaatagcgcctccttctctacctttaagt gctatggcgtgtcccccacaaagctgaacgac ctgtgcttcaccaacgtgtacgccgactcttttgt gatcaggggcgatgaggtgcgccagatcgc acctggacagacaggcaagatcgccgactac aactataagctgccagacgatttcaccggct gcgtgatcgcctggaatagcaacaatctggatt ccaaagtgggcggcaactacaattatctgtac cggctgttcagaaagagcaacctgaagccctt tgagcgggatatcagcacagagatctaccag gcaggctccaccccttgcaacggagtggagg gcttcaattgttattttcccctgcagagctacggc ttccagcctacaaatggcgtgggctatcagcca tacagggtggtggtgctgtcctttgagctgctg cacgcacctgcaaccgtgtcctctggacacatc gagggccgccacatgctggagatgggccatc atcaccatcatcaccaccaccaccactgatag cggccgctcgagtctagagggcccgtttaaac ccgctgatcagcctcgactgtgccttctagtt gccagccatctgttgtttgcccctcccccgtg ccttccttgaccctggaaggtgccactcccac tgtcctttcctaataaaatgaggaaattgcat cgcattgtctgagtaggtgtcattctattctgggg ggtggggtggggcaggacagcaaggggga ggattgggaagacaatagcaggcatgctggg gatgcggtgggctctatggcttctgaggcggaa agaaccagctggggctctagggggtatcccca cgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcg ggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctac acttgccagcgccctagcgcccgctcctttcg ctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctt tccccgtcaagctctaaatcgggggctcccttta gggttccgatttagtgctttacggcacctcgacc ccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgta gtgggccatcgccctgatagacggtttttcgcc ctttgacgttggagtccacgttctttaatagtg gactcttgttccaaactggaacaacactcaacc ctatctcggtctattcttttgatttataagggatttt gccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctg atttaacaaaaatttaacgcgaattaattctgt ggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccc caggctccccagcaggcagaagtatgcaaag catgcatctcaattagtcagcaaccaggtgtgg aaagtccccaggctccccagcaggcagaagt atgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaac catagtcccgcccctaactccgcccatcccgc ccctaactccgcccagttccgcccattctccgcc ccatggctgactaattttttttatttatgcagaggc cgaggccgcctctgcctctgagctattccagaa gtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttg caaaaagctcccgggagcttgtatatccattttc ggatctgatcaagagacaggatgaggatcgttt cgcatgattgaacaagatggattgcacgcagg ttctccggccgcttgggtggagaggctattcggc tatgactgggcacaacagacaatcggctgctct gatgccgccgtgttccggctgtcagcgcagggg cgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccgg tgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttcct tgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcg ggaagggactggctgctattgggcgaagtgcc ggggcaggatctcctgtcatctcaccttgctcctg ccgagaaagtatccatcatggctgatgcaatg cggcggctgcatacgcttgatccggctacctgc ccattcgaccaccaagcgaaacatcgcatcg agcgagcacgtactcggatggaagccggtct tgtcgatcaggatgatctggacgaagagcat caggggctcgcgccagccgaactgttcgcca ggctcaaggcgcgcatgcccgacggcgagg atctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttg ccgaatatcatggtggaaaatggccgctttt ctggattcatcgactgtggccggctgggtgt ggcggaccgctatcaggacatagcgttggct acccgtgatattgctgaagagcttggcggcg aatgggctgaccgcttcctcgtgctttacgg tatcgccgctcccgattcgcagcgcatcgcc ttctatcgccttcttgacgagttcttctgagcg ggactctggggttcgaaatgaccgaccaag cgacgcccaacctgccatcacgagatttcgat tccaccgccgccttctatgaaaggttgggctt cggaatcgttttccgggacgccggctggatga tcctccagcgcggggatctcatgctggagt tcttcgcccaccccaacttgtttattgcagctta taatggttacaaataaagcaatagcatcacaa atttcacaaataaagcatttttttcactgcatt ctagttgtggtttgtccaaactcatcaatgtat cttatcatgtctgtataccgtcgacctctagct agagcttggcgtaatcatggtcatagctgtttc ctgtgtgaaattgttatccgctcacaattccacac aacatacgagccggaagcataaagtgtaaag cctggggtgcctaatgagtgagctaactcacat taattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtc gggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaa tcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcg tattgggcgctcttccgcttcctcgctcactgactc gctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggt atcagctcactcaaaggcggtaatacggttatc cacagaatcaggggataacgcaggaaagaa catgtgagcaaaaggccagcaaaaggccag gaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttt tccataggctccgcccccctgacgagcatcac aaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaa acccgacaggactataaagataccaggcgtt tccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgtt ccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcc tttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcat agctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtag gtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaa ccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatcc ggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaag acacgacttatcgccactggcagcagccactg gtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggc ggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaact acggctacactagaagaacagtatttggtatc tgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaa aagagttggtagctcttgatccggcaaacaaa ccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgca agcagcagattacgcgcagaaaaaaaggat ctcaagaagatcctttgatcttttctacggggt ctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaa gggattttggtcatgagattatcaaaaaggatct tcacctagatccttttaaattaaaaatgaagtt ttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaactt ggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgagg cacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatcca tagttgcctgactccccgtcgtgtagataactac gatacgggagggcttaccatctggccccagtg ctgcaatgataccgcgagacccacgctcacc ggctccagatttatcagcaataaaccagccag ccggaagggccgagcgcagaagtggtcctg caactttatccgcctccatccagtctattaattgtt gccgggaagctagagtaagtagttcgccagtt aatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacag gcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatgg cttcattcagctccggttcccaacgatcaaggc gagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaag cggttagctccttcggtcctccgatcgttgtca gaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggt tatggcagcactgcataattctcttactgtcatg ccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagta ctcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcg gcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacg ggataataccgcgccacatagcagaactttaa aagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggc gaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagat ccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaact gatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttc tgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgc cgcaaaaaagggaataagggcgacacgga aatgttgaatactcatactcttcctttttcaat attattgaagcatttatcagggttattgtc tcatgagcggatacatatttgaatgtattt agaaaaataaacaaataggggttccgcgca catttccccgaaaagtgccacctgacgtc | ||
| LgBiT | Promega | N3030 | |
| penicillin Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Pierce Protein G Magnetic Beads | Thermo Fisher Scientific | 88848 | |
| PolyJet In Vitro DNA Transfection Reagent | Signagen | SL100688.5 | |
| SARS-CoV-2 (2019-nCoV) Spike Neutralizing Antibody, Mouse Mab | SinoBiological | 40592-MM57 | |
| Synergy Mx Microplate Reader | BioTek | 96-well plate reader luminometer | |
| Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 2520056 | 0.25% |
References
- Ullah, H., Ullah, A., Gul, A., Mousavi, T., Khan, M. W. Novel coronavirus 2019 (COVID-19) pandemic outbreak: A comprehensive review of the current literature. Vacunas. , (2020).
- Coronavirus update (Live). Worldometer Available from: https://www.worldometers.info/coronavirus/ (2021)
- Cacciapaglia, G., Cot, C., Sannino, F. Second wave COVID-19 pandemics in Europe: a temporal playbook. Scientific Reports. 10 (1), 15514 (2020).
- COVID-19 vaccines. World Health Organization Available from: https://www.who.int/emergencies/diseases/novel-coronavirus-2019/covid-19-vaccines (2021)
- Hueston, L., et al. The antibody response to SARS-CoV-2 infection. Open Forum Infectious Diseases. 7 (9), (2020).
- Lan, J., et al. Structure of the SARS-CoV-2 spike receptor-binding domain bound to the ACE2 receptor. Nature. 581 (7807), 215-220 (2020).
- Azad, T., et al. Implications for SARS-CoV-2 vaccine design: fusion of Spike glycoprotein transmembrane domain to receptor-binding domain induces trimerization. Membranes. 10 (9), 215 (2020).
- Piccoli, L., et al. Mapping neutralizing and immunodominant sites on the SARS-CoV-2 Spike receptor-binding domain by structure-guided high-resolution serology. Cell. 183 (4), 1024-1042 (2020).
- Premkumar, L., et al. The receptor-binding domain of the viral spike protein is an immunodominant and highly specific target of antibodies in SARS-CoV-2 patients. Science Immunology. 5 (48), (2020).
- Walls, A. C., et al. Elicitation of potent neutralizing antibody responses by designed protein nanoparticle vaccines for SARS-CoV-2. Cell. 183 (5), 1367-1382 (2020).
- Azad, T. Nanoluciferase complementation-based biosensor reveals the importance of N- linked glycosylation of SARS-CoV-2 Spike for viral entry. Mol Ther. , 0074-0075 (2021).
- Bastos, M. L., et al. Diagnostic accuracy of serological tests for covid-19: systematic review and meta-analysis. BMJ. 370, 2516 (2020).
- Bioluminescent Reporters | Reporter Gene Applications | An Introduction to Reporter Genes. Promega Available from: https://www.promega.ca/resources/guides/cell-biology/bioluminescent-reporters/#references-6d127eb8-eeae-40b7-86e9-fe300545e8fa (2021)
- Fleiss, A., Sarkisyan, K. S. A brief review of bioluminescent systems. Current Genetics. 65 (4), 877-882 (2019).
- Nouri, K., et al. A kinome-wide screen using a NanoLuc LATS luminescent biosensor identifies ALK as a novel regulator of the Hippo pathway in tumorigenesis and immune evasion. The FASEB Journal. 33 (11), 12487-12499 (2019).
- Boute, N., et al. NanoLuc Luciferase – a multifunctional tool for high throughput antibody screening. Frontiers in Pharmacology. 7, 27 (2016).
- Nouri, K., et al. Identification of celastrol as a novel YAP-TEAD inhibitor for cancer therapy by high throughput screening with ultrasensitive YAP/TAZ-TEAD biosensors. Cancers. 11 (10), 1596 (2019).
- Azad, T., et al. SARS-CoV-2 S1 NanoBiT: A nanoluciferase complementation-based biosensor to rapidly probe SARS-CoV-2 receptor recognition. Biosensors and Bioelectronics. 180, 113122 (2021).
- Brown, E. E. F., et al. Characterization of critical determinants of ACE2-SARS CoV-2 RBD interaction. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2268 (2021).
- Azad, T., et al. A gain-of-functional screen identifies the Hippo pathway as a central mediator of receptor tyrosine kinases during tumorigenesis. Oncogene. 39 (2), 334-355 (2020).
- Schwinn, M. K., et al. CRISPR-Mediated tagging of endogenous proteins with a luminescent peptide. ACS Chemical Biology. 13 (2), 467-474 (2018).
- Azad, T., et al. A high-throughput NanoBiT-based serological assay detects SARS-CoV-2 seroconversion. Nanomaterials. 11 (3), 807 (2021).
