הקרנת פפטידים המפעילים MRGPRX2 באמצעות תאי HEK מהונדסים
Summary
טכניקות ליצירת ספרייה של פפטידים קצרים שיכולים להפעיל תאי פיסט באמצעות קולטן MRGPRX2 מתוארים. טכניקות הקשורות הן קלות, זולות, וניתן להרחיבן לקולטני תאים אחרים.
Abstract
זיהוי ליגנדים ספציפיים קולטני תאים משמעותיים מבחינה טיפולית הוא חיוני עבור יישומים רבים, כולל עיצוב ופיתוח של טיפולים חדשים. קולטן G-חלבון-X2 (MRGPRX2) הקשור ל-Mas הוא קולטן חשוב המווסת את הפעלת תאי התורן, ולכן מכוון את התגובה החיסונית הכללית. ליגנדים רבים עבור MRGPRX2 זוהו וכוללים פפטידים אנדוגניים כמו PAMPs, defensins, LL-37 ורסיסי חלבון אחרים (כלומר, אלבומין מושפל). זיהוי נוסף של ליגנדים ספציפיים MRGPRX2 דורש הקרנה של מספר רב של פפטידים (כלומר, ספריית פפטיד); עם זאת, תאי פיסט קשה ויקרים לתחזוקה במבחנה, ולכן, לא חסכוני להשתמש עבור הקרנת מספר גדול של מולקולות. המאמר הנוכחי מדגים שיטה לעיצוב, פיתוח ומסך של ספריה של מולקולות פפטיד קטנות באמצעות MRGPRX2 המבטאות תאי HEK. קו תא זה הוא קל יחסית וזול לתחזוקה וניתן להשתמש בו לניתוח תפוקה גבוהה במבחנה. צבע פלואורסצנטי רגיש לסידן Fura-2 לסימון שטף סידן תאי בעת ההפעלה שימש לניטור ההפעלה. היחס בין עוצמת הפלואורסצנטיות של Fura-2 ב 510 ננומטר נגד אורכי גל עירור של 340 ו 380 ננומטר שימש לחישוב ריכוז סידן. ספריית הפפטיד המשמשת לאימות מערכת זו התבססה על סוד ה- N-terminal 12 (PAMP-12) האנדוגני, הידוע כאגוגה של MRGPRX2 עם ספציפיות גבוהה וזיקה. פפטידים הבאים נוצרו באמצעות truncation חומצת אמינו וטכניקות סריקת אלנין להחיל PAMP-12. השיטה המתוארת כאן היא פשוטה וזולה אך חסון להקרנת ספרייה גדולה של תרכובות לזיהוי תחומים מחייבים ופרמטרים חשובים אחרים הממלאים תפקיד חשוב בהפעלת קולטן.
Introduction
תאי פיסט הם חלק בלתי נפרד ממערכת החיסון וממלאים תפקיד מכריע הן בתגובות חיסוניות מולדות והן בתגובות חיסוניות אדפטיביות. תאי פיסט מופעלים בעיקר על ידי כריכת אנטיגן לאימונוגלובולין E (IgE) – קומפלקס קולטני FcεRI, או על ידי קולטן G-חלבון הקשור ל- G-X2 (MRGPRX2)שהתגלהלאחרונה . הפעלת MRGPRX2 נקשרה למספר מחלות חיסוניות ודלקתיות, ולכן חשוב להבין את מנגנון המחייב של הקולטן לליגנדים2שלו . כדי לעשות זאת, ספרייה של מולקולות פפטיד קטנות פותחה והוקרנה נגד קולטני MRGPRX2 שהתבטאו יתר על המידה בתאי HEK. במחקר, ספריית הפפטיד נבנתה בטכניקות פשוטות ורב-תכליתיות של סריקת אלנין וגזמת חומצות אמינו. סריקת אלנין כרוכה בהחלפת חומצות אמינו ספציפיות בשאריות אלנין. אלנין להיות קטן ונייטרלי, מפשיט את הפפטיד של המאפיינים הספציפיים שהוענקו על ידי שאריות מוחלף ברצף מדגיש את המשמעות של המאפיינים הפיזיוכימיים בהתאמה של חומצת האמינו באינטראקציות קולטן. להיפך, ב truncation חומצת אמינו, רצפי פפטיד מתוכננים כך שהוא חסר אחד או יותר שאריות חומצת אמינו מן מסוף N-terminal, C, או שניהם. קבוצה זו של פפטידים שימשה לזיהוי רצפי חומצות האמינו החיוניים לכריכת MRGPRX2.
ניסיון עם קווי תאי פיסט אנושיים (LAD-2) הראה כי תאים אלה קשים לתרבות ולשמור במבחנה: זמן הכפלה של שבועיים, תוספי מזון בינוניים יקרים, ותשומת לב ישירה הנדרשת במהלך passaging3. תכונות אלה הופכות את התאים ללא מתאימים להקרנה בקנה מידה גדול של ליגנדים פוטנציאליים. בזאת, תאי HEK מהודבקים בייצוב המבטאים קולטן MRGPRX2 (HEK-X2) שימשו להקרנת ספריית הפפטיד1. תאי HEK-293 נמצאים בשימוש נרחב ונחקרים עבור הביטוי ההטרולוגי של קולטני פני השטח בשל יעילות ההדבקה הגבוהה שלהם, קצב הכפלה מהיר יותר, והצורך בתוספי מזון בינוניים לא יקרים להיות מתורבתים במעבדה4. הפרוטוקול כדי להעביר את קו התא HEK-293 הוכח והוא מבוסס היטב5. תאי HEK-293 המביעים ביציבות קולטן MRGPRX2 (מעבר 13-19) הופעלו עם הפפטידים שנוצרו באמצעות N-truncation, C-truncation, N + C-truncation, וסריקת אלנין1. תאי HEK מסוג פראי (HEK-WT) (מעבר 16-21) שימשו כפקד. שחרור סידן תאי בעת ההפעלה היה במעקב כדי ללמוד את ההפעלה מבוססת MRGPRX2.
הפעלת תאים על ידי MRGPRX2 מלווה בגיוס סידן ציטוטוסולי. שחרור סידן תאי מוסדר זה בתאי פיסט מוסדר על ידי הזנת סידן המופעלת על ידי החנות (SOCE), מתואם על ידי מולקולת אינטראקציה סטרומה 1 (STIM1); והוא מרכזי מפל התגובה החיסונית6,7. שיטות שונות שימשו כדי לזהות ריכוז סידן תאי, כולל מהדקי תיקון וצבעים פלואורסצנטיים8. מכל הטכניקות הזמינות, צבעי סידן פלואורומטריים בהטיה עם טכניקות זיהוי שונות נמצאים בשימוש נרחב9. שני סוגים של צבעים פלואורומטריים שצברו תחומי עניין הם כלומר, צבעי אורך גל יחידים כמו Fluo-4, וצבעים רציאליים באורך גל כפול כמו Indo -1 ו Fura-2. היתרון שצבעים רציוניים אורך גל כפולים מביאים על צבעי אורך גל יחיד הוא שהצבעים היחסיים נכונים לטעויות ניסיוניות כמו טעינת צבע, הלבנת תמונות ומיקוד10,11.
אצטטוקסימתיל אסתר (Fura-2 AM) הוא צבע מחלחל לירוק-פלואורסצנטי, אשר עירורו עובר לאורך גל נמוך יותר עם כריכת סידן. באופן ניסיוני, Fura-2 מתרגש ב 340 ו 380 ננומטר, בעוד הפליטה נרשמת ב 510 ננומטר. לאחר כריכת הסידן, עוצמת הפלואורסצנט ב-340 ננומטר עולה בעוד זו של 380 ננומטר פוחתת, כפי שמוצג באיור 1. הנתונים מיוצגים כיחס של עוצמת פלואורסצנטיות לאחר עירור ב- 340 ננומטר (F340) לזה של עוצמה לאחר עירור ב- 380 ננומטר (F380) כלומר, F340/F380. יחס F340/F380 הוא פרופורציונלי לסידן תאי, אשר הערך של אשר ניתן לחשב על ידי משוואת Grynkiewicz12. מכיוון שאות הפלואורסצנטיות מתקבל מערעור הצבע בשני אורכי גל (340 ננומטר ו-380 ננומטר), היחס בין אותות הפלואורסצנטיות מתקן גורמים ניסיוניים כמו טעינת צבע, דליפת צבע, ליחתום תמונות וצפיפות תאים.
Protocol
Representative Results
Discussion
איתות סידן הוא מרכזי לפירוק תאי התורן והיה בשימוש נרחב במחקר של אינטראקציות קולטן-ליגנד, זיהוי ליגנד, וגילוי סמים14. MRGPRX2 הוא קולטן תא תורן שהתגלה לאחרונה ונמצא ממלא תפקיד מפתח במחלות דלקתיות רבות כמו גירוד, אסטמה, אטופיק דרמטיטיס, בין היתר2. יתר על כן, מספר תרופות ש?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SR ו- LDU רוצים להכיר אלברטה Innovates פרויקט מחקר אסטרטגי, NRC, ו NSERC-דיסקברי מענק עבור פרויקט זה.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | 5470 | |
| Calcium Chloride | Sigma Aldrich | 793939 | |
| Corning 96 Well | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| Black Polystyrene Microplate | Sigma Aldrich | CLS3603 | |
| DMEM | Thermo Fischer | 11995065 | High Glucose |
| DMSO | Thermo Fischer | D12345 | Sterile, biological grade |
| EGTA | Sigma Aldrich | E3889 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fischer | 12483-020 | |
| Flexstation 3 | Molecular devices | FV06060 | |
| Fura-2 AM | Thermo Fischer | F1221 | |
| Glucose | Sigma Aldrich | D8270 | |
| HEPES buffer | Thermo Fischer | 15630-080 | |
| Ionomycin | Sigma Aldrich | I9657 | |
| L Glutamine | Thermo Fischer | 25030-081 | |
| Pen Strep | Thermo Fischer | 15140122 | |
| Peptides | RS Syntehsis | Custom | ≥95% pure; N terminal – acetyl group C terminal – amide group |
| Potassium Chloride | Sigma Aldrich | 12636 | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S9888 | |
| TritonX-100 | DOW Chemical | 166704 |
References
- McNeil, B. D., et al. Identification of a mast-cell-specific receptor crucial for pseudo-allergic drug reactions. Nature. 519 (7542), 237-241 (2015).
- Subramanian, H., Gupta, K., Ali, H. Roles of Mas-related G protein-coupled receptor X2 on mast cell-mediated host defense, pseudoallergic drug reactions, and chronic inflammatory diseases. Journal of Allergy and Clinical Immunology. 138 (3), 700-710 (2016).
- Rådinger, M., Jensen, B. M., Kuehn, H. S., Kirshenbaum, A., Gilfillan, A. M. Generation, isolation, and maintenance of human mast cells and mast cell lines derived from peripheral blood or cord blood. Current protocols in immunology. , (2010).
- Thomas, P., Smart, T. G. HEK293 cell line: A vehicle for the expression of recombinant proteins. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 51 (3), 187-200 (2005).
- Subedi, G. P., Johnson, R. W., Moniz, H. A., Moremen, K. W., Barb, A. High yield expression of recombinant human proteins with the transient transfection of HEK293 cells in suspension. Journal of Visualized Experiments. (106), e53568 (2015).
- Occhiuto, C. J., et al. Store-operated calcium entry via STIM1 contributes to MRGPRX2 induced mast cell functions. Frontiers in Immunology. 10, 3143 (2020).
- Baba, Y., et al. Essential function for the calcium sensor STIM1 in mast cell activation and anaphylactic responses. Nature Immunology. 9 (1), 81-88 (2008).
- Hoth, M., Penner, R. Depletion of intracellular calcium stores activates a calcium current in mast cells. Nature. 355 (6358), 353-356 (1992).
- Assinger, A., Volf, I., Schmid, D. A novel, rapid method to quantify intraplatelet calcium dynamics by ratiometric flow cytometry. PLoS One. 10 (4), 0122527 (2015).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Malgaroli, A., Milani, D., Meldolesi, J., Pozzan, T. Fura-2 measurement of cytosolic free Ca2+ in monolayers and suspensions of various types of animal cells. The Journal of Cell Biology. 105 (5), 2145-2155 (1987).
- Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsienb, R. Y. A New Generation of Ca2 + Indicators with Greatly Improved Fluorescence Properties. Journal of Biological Chemistry. 260 (6), 3440-3450 (1985).
- Lu, L., Parmar, M. B., Kulka, M., Kwan, P., Unsworth, L. D. Self-assembling peptide nanoscaffold that activates human mast cells. ACS Applied Materials and Interfaces. 10 (7), 6107-6117 (2018).
- Lansu, K., et al. In silico design of novel probes for the atypical opioid receptor MRGPRX2. Nature Chemical Biology. 13 (5), 529-536 (2017).
- Navinés-Ferrer, A., et al. MRGPRX2-mediated mast cell response to drugs used in perioperative procedures and anaesthesia. Scientific Reports. 8 (1), 11628 (2018).
- Johnson, M. Calcium imaging of store-operated calcium (Ca 2+) entry (SOCE) in HEK293 cells using Fura-2. Calcium Signalling. , 163-172 (2019).
- Tinning, P. W., Franssen, A. J. P. M., Hridi, S. U., Bushell, T. J., McConnell, G. A 340/380 nm light-emitting diode illuminator for Fura-2 AM ratiometric Ca2+ imaging of live cells with better than 5 nM precision. Journal of Microscopy. 269 (3), 212-220 (2018).
