Criblage des peptides qui activent MRGPRX2 à l’aide de cellules HEK modifiées

Les mastocytes font partie intégrante du système immunitaire et jouent un rôle crucial dans les réponses immunitaires innées et adaptatives. Les mastocytes sont principalement activés soit par la liaison d’un antigène au complexe de récepteurs immunoglobuline E (IgE) – FcεRI, soit par le récepteur X2 de la protéine G (MRGPRX2)récemment découvert. L’activation de MRGPRX2 a été liée à plusieurs maladies immunitaires et inflammatoires, et par conséquent, il est important de comprendre le mécanisme de liaison du récepteur à ses ligands². Pour ce faire, une bibliothèque de petites molécules peptidiques a été développée et filtrée contre les récepteurs MRGPRX2 qui étaient surexprimés dans les cellules HEK. Dans l’étude, la bibliothèque de peptides a été construite en utilisant les techniques simples et polyvalentes de balayage de l’alanine et de troncature d’acides aminés. Le balayage de l’alanine consiste à remplacer des acides aminés spécifiques par un résidu d’alanine. L’alanine étant petite et neutre, dépouille le peptide des propriétés spécifiques conférées par le résidu remplacé et souligne consécutivement l’importance des propriétés physiochimiques respectives de l’acide aminé dans les interactions avec les récepteurs. Au contraire, dans la troncature d’acides aminés, les séquences peptidiques sont conçues de telle sorte qu’il manque un ou plusieurs résidus d’acides aminés du terminal N, du terminal C ou des deux. Cet ensemble de peptides a été utilisé pour identifier les séquences d’acides aminés cruciales pour la liaison MRGPRX2.

L’expérience avec les lignées de mastocytes humains (LAD-2) a montré que ces cellules sont difficiles à mettre en culture et à maintenir in vitro: un temps de doublement de deux semaines, des suppléments de milieu coûteux, et une attention directe requise lors du passage^3. Ces attributs rendent les cellules impropres au dépistage à grande échelle de ligands potentiels. Ici, des cellules HEK transfectées de manière stable exprimant le récepteur MRGPRX2 (HEK-X2) ont été utilisées pour filtrer la bibliothèque peptidique¹. Les cellules HEK-293 sont largement utilisées et étudiées pour l’expression hétérologue des récepteurs de surface en raison de leur efficacité de transfection élevée, de leur taux de doublement plus rapide et de la nécessité de mettre en culture des suppléments de milieu non coûteux en laboratoire^4. Le protocole de transfecter la lignée cellulaire HEK-293 a été démontré et est bien établi⁵. Les cellules HEK-293 exprimant de manière stable le récepteur MRGPRX2 (passage 13-19) ont été activées avec les peptides générés par N-troncature, C-troncature, N+C-troncature et balayage de l’alanine^1. Des cellules HEK de type sauvage (HEK-WT) (passage 16-21) ont été utilisées comme témoins. La libération intracellulaire de calcium lors de l’activation a été surveillée pour étudier l’activation basée sur MRGPRX2.

L’activation cellulaire par MRGPRX2 est suivie d’une mobilisation cytosolique du calcium. Cette libération intracellulaire régulée de calcium dans les mastocytes est régulée par l’entrée de calcium opérée par le magasin (SOCE), coordonnée par la molécule d’interaction stromale 1 (STIM1); et est au cœur de la cascade de réponse immunitaire^6,7. Diverses méthodes ont été utilisées pour détecter la concentration intracellulaire de calcium, y compris les patch-clamps et les colorants fluorescents⁸. De toutes les techniques disponibles, les colorants calciques fluorométriques en conjugaison avec diverses techniques de détection sont largement utilisés⁹. Deux types de colorants fluorométriques qui ont gagné en intérêt sont, à savoir, les colorants à longueur d’onde unique comme Fluo-4 et les colorants ratiométriques à double longueur d’onde comme Indo-1 et Fura-2. L’avantage que les colorants ratiométriques à double longueur d’onde apportent par rapport aux colorants à longueur d’onde unique est que les colorants ratiométriques corrigent les erreurs expérimentales telles que le chargement des colorants, le photo-blanchiment et la mise au point^10,11.

L’ester acétoxyméthylé de Fura-2 (Fura-2 AM) est un colorant fluorescent vert imprégné de cellules dont l’excitation se déplace vers une longueur d’onde inférieure lors de la liaison au calcium. Expérimentalement, Fura-2 est excité à 340 et 380 nm, tandis que l’émission est enregistrée à 510 nm. Lors de la liaison au calcium, l’intensité fluorescente à 340 nm augmente tandis que celle de 380 nm diminue, comme le montre la figure 1. Les données sont représentées sous la forme d’un rapport entre l’intensité de fluorescence après excitation à 340 nm (F340) et celle de l’intensité après excitation à 380 nm (F380), c’est-à-dire F340/F380. Le rapport F340/F380 est proportionnel au calcium intracellulaire, dont la valeur peut être calculée par l’équation de Grynkiewicz¹². Étant donné que le signal de fluorescence est obtenu à partir de l’excitation du colorant à deux longueurs d’onde (340 nm et 380 nm), le rapport des signaux de fluorescence corrige les facteurs expérimentaux tels que la charge en colorant, les fuites de colorant, le photomélancage et les densités cellulaires.