השגת סינון מקטעים יעיל במתקן XChem ב-Diamond Light Source
Summary
מאמר זה מתאר את תהליך XChem המלא לסינון מקטעים מבוסס גביש, החל מהגשת בקשה לגישה וכל השלבים הבאים להפצת נתונים.
Abstract
בגילוי תרופות מבוססות פרגמנטים, מאות או לעתים קרובות אלפי תרכובות קטנות מ~300 Da נבדקות מול החלבון המעניין כדי לזהות ישויות כימיות שניתן לפתח לתרופות מועמדות חזקות. מכיוון שהתרכובות קטנות, האינטראקציות חלשות, ולכן שיטת הסינון חייבת להיות רגישה מאוד; יתר על כן, מידע מבני נוטה להיות חיוני לפירוט פגיעות אלה לתרכובות דמויות עופרת. לכן, קריסטלוגרפיה של חלבונים תמיד הייתה טכניקה סטנדרטית זהב, אך היסטורית מאתגרת מכדי למצוא שימוש נרחב כמסך ראשי.
ניסויים ראשוניים של XChem הודגמו בשנת 2014 ולאחר מכן נוסו עם משתפי פעולה אקדמיים ותעשייתיים כדי לאמת את התהליך. מאז, מאמץ מחקרי גדול וזמן אלומה משמעותי ייעלו את הכנת הדגימות, פיתחו ספריית מקטעים עם אפשרויות מעקב מהירות, הפכו את היכולת של I04-1 beamline לאיסוף נתונים ללא השגחה ושיפרו אותה, ויישמו כלים חדשים לניהול נתונים, ניתוח וזיהוי פגיעות.
XChem הוא כעת מתקן לסינון מקטעים קריסטלוגרפיים בקנה מידה גדול, התומך בכל תהליך הגבישים עד לשיקוע, ונגיש למשתמשים אקדמיים ותעשייתיים ברחבי העולם. תוכנית המשתמשים האקדמיים שעברו ביקורת עמיתים פותחה באופן פעיל מאז 2016, כדי להתאים לפרויקטים בהיקף מדעי רחב ככל האפשר, כולל פרויקטים מתוקפים היטב, כמו גם גישוש. הגישה האקדמית מוקצית באמצעות קולות קוראים דו-שנתיים להצעות שעברו ביקורת עמיתים, ועבודה קניינית מסודרת על ידי קבוצת הקישור התעשייתי של דיאמונד. תהליך עבודה זה כבר מיושם באופן שגרתי על למעלה ממאה מטרות מתחומים טיפוליים מגוונים, ומזהה ביעילות קלסרים חלשים (שיעור פגיעה של 1%-30%), המשמשים הן כנקודות מוצא איכותיות לתכנון תרכובת והן מספקים מידע מבני נרחב על אתרי קשירה. עמידות התהליך הודגמה על ידי המשך סינון מטרות SARS-CoV-2 במהלך מגיפת COVID-19, כולל סיבוב של 3 שבועות עבור הפרוטאז הראשי.
Introduction
גילוי תרופות מבוסס פרגמנטים (FBDD) היא אסטרטגיה נפוצה לגילוי עופרת, ומאז הופעתה לפני 25 שנה, היא סיפקה ארבע תרופות לשימוש קליני ויותר מ -40 מולקולות קודמו לניסויים קליניים 1,2,3. פרגמנטים הם ישויות כימיות קטנות בדרך כלל עם משקל מולקולרי של 300 Da או פחות. הם נבחרים בשל המורכבות הכימית הנמוכה שלהם, המספקים נקודות התחלה טובות לפיתוח מעכבי ליגנד יעילים מאוד עם תכונות פיסיקוכימיות מצוינות. גודלם אומר שהם דוגמים את נוף הקישור של חלבונים בצורה יסודית יותר מאשר ספריות של תרכובות גדולות יותר דמויי תרופות או עופרת, וכך גם חושפים נקודות חמות ואתרים אלוסטריים משוערים. בשילוב עם מידע מבני, המקטעים מספקים מפה מפורטת של האינטראקציות המולקולריות האפשריות בין חלבון לליגנד. עם זאת, זיהוי ואימות אמינים של ישויות אלה, הנוטות להיקשר חלש לחלבון המטרה, דורש מערך של שיטות סינון ביופיזיות חזקות ורגישות כגון תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), תהודה מגנטית גרעינית (NMR), או קלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC)4,5.
קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן היא חלק חיוני מארגז הכלים של FBDD: היא רגישה מספיק כדי לזהות קלסרים חלשים ומניבה ישירות מידע מבני על האינטראקציות ברמה המולקולרית. הוא משלים מסכים ביופיזיקליים אחרים ובדרך כלל חיוני לקידום פגיעות פרגמנטים לתרכובות עופרת; זה דורש מערכות גבישים באיכות גבוהה, כלומר התגבשות היא מאוד לשחזור, גבישים אידיאלי diffract כדי טוב יותר מ 2.8 Å רזולוציה.
מבחינה היסטורית, היה קשה מאוד להשתמש בקריסטלוגרפיה כמסך פרגמנט ראשוני 6,7,8, בין אם באקדמיה ובין אם בתעשייה. לעומת זאת, סינכרוטרונים השיגו שיפורים בסדר גודל ברובוטיקה, אוטומציה 9,10,11 וטכנולוגיית גלאים 12,13, ובשילוב עם כוח מחשוב מואץ באותה מידה ואלגוריתמים של עיבוד נתונים14,15,16, ניתן למדוד מערכי נתונים שלמים של עקיפה בשניות ומספרים גדולים מהם ללא השגחה, כפי שחלוץ ב- LillyCAT7 ומאוחר יותר MASSIF17,18 (מתקן קרינת סינכרוטרון אירופי (ESRF)). זה הוביל את הסינכרונים לפתח פלטפורמות יעילות ביותר כדי להפוך את סינון המקטעים מבוסס הגביש כמסך ראשי לנגיש לקהילת משתמשים רחבה (XChem at Diamond; CrystalDirect ב-EMBL/ESRF19; BESSY בהלמהולץ-צנטרום ברלין20; FragMax ב- MaxIV21).
מאמר זה מתעד את הפרוטוקולים המרכיבים את פלטפורמת XChem להקרנת מקטעים על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, החל מהכנת הדגימה ועד לתוצאות המבניות הסופיות של פגיעות במודל תלת-ממדי. הצינור (איור 1) דרש פיתוח גישות חדשות לזיהוי גבישים 22, השריה 23 וקצירת24, כמו גם תוכנת ניהול נתונים 25 וגישה אלגוריתמית לזיהוי מקטעים 26 שנמצאת כיום בשימוש נרחב בקהילה. טכנולוגיית קצירת הגבישים נמכרת כעת על ידי ספק (ראה טבלת חומרים), והזמינות הפתוחה של הכלים אפשרה לסינכרונים אחרים להתאים אותם להקמת פלטפורמות מקבילות21. פרויקטים מתמשכים עוסקים בניתוח נתונים, השלמת מודלים והפצת נתונים באמצעות פלטפורמת Fragalysis27. מעבדת הכנת הדגימות צמודה לקו האלומה I04-1, מה שמפשט את הלוגיסטיקה של העברת מאות דגימות קפואות לקו האלומה וזמן אלומה ייעודי על I04-1 מאפשר משוב רנטגן מהיר שינחה את הקמפיין.
XChem היא חלק בלתי נפרד מתוכנית המשתמשים של דיאמונד, עם שתי שיחות בשנה (תחילת אפריל ואוקטובר). תהליך ביקורת העמיתים שוכלל תוך התייעצות עם מומחים לגילוי תרופות מהאקדמיה והתעשייה. יחד עם טיעון מדעי חזק, תהליךההצעה 28 דורש מהמועמדים להעריך בעצמם לא רק את נכונותה של מערכת הגבישים, אלא גם את מומחיותם בשיטות ביוכימיות ואורתוגונליות ביופיזיקליות ויכולתם להתקדם בבדיקות סקר באמצעות כימיה עוקבת. דרכי הגישה התפתחו גם כדי להתאים לקהילת המשתמשים הרב-תחומית:
רמה 1 (פרויקט יחיד ) מיועדת לפרויקטים בשלב הגישוש וכלי אימות פגיעות (ביופיזיקה או כלים ביוכימיים) ואסטרטגיות מעקב לא צריכות להיות במקום. אם יתקבל, הפרויקט יקבל מספר מופחת של משמרות זמן אלומה, מספיק להוכחת היתכנות.
רמה 2 (פרויקט יחיד) מיועדת לפרויקטים מאומתים היטב ודורשת כלים במורד הזרם ואסטרטגיות מעקב כדי להיות במקום. אם יתקבל, יוקצה לפרויקט מספיק זמן קרן לקמפיין סינון מלא של פרגמנטים. פרויקטים בודדים (רמה 1 או רמה 2) יושלמו במהלך 6 החודשים של תקופת ההקצאה (אפריל עד ספטמבר או אוקטובר עד מרץ).
Block Allocation Group (BAG) מיועד לקונסורציום של קבוצות ופרויקטים, שבו מתקיים תהליך חזק של בחירת יעדים ותעדוף בתוך ה-BAG, יחד עם צינור מעקב ברור. ל-BAGs חייב להיות לפחות מומחה אחד שעבר הכשרה מלאה של XChem (משתמש-על), אשר מתאם את פעילותם עם צוות Diamond ומכשיר את חברי BAG. מספר משמרות זמן הקרן המוקצה מוגדר על ידי מספר הפרויקטים החזקים מבחינה מדעית ב- BAG ומוערך מחדש לכל תקופת הקצאה בהתבסס על דוח ה- BAG. הגישה זמינה למשך שנתיים.
ניסוי XChem מחולק לשלושה שלבים, עם נקודת החלטה עבור כל אחד מהם: מבחן סבילות לממס, טרום מסך ומסך ראשי (איור 2). בדיקת סבילות הממס מסייעת להגדיר את פרמטרי ההשריה, את כמות הממס (DMSO, אתילן גליקול או חומרי הקפאה אחרים במידת הצורך) שהמערכת הגבישית יכולה לסבול ולכמה זמן. ריכוזי הממסים נעים בדרך כלל בין 5%-30% על פני שתי נקודות זמן לפחות. נתוני עקיפה נאספים ומושווים לעקיפה הבסיסית של מערכת הגביש; פעולה זו תקבע את פרמטרי ההשריה לשלב הבא. עבור המסך המקדים, 100-150 תרכובות מושרות בתנאים שנקבעו במבחן הממס, ומטרתו לאשר כי הגבישים יכולים לסבול את התרכובות בתנאים אלה. במידת הצורך, ההקפאה מתווספת לאחר מכן לטיפות שכבר מכילות את השברים. קריטריוני ההצלחה הם ש-80% או יותר מהגבישים שורדים מספיק טוב כדי להניב נתוני עקיפה באיכות טובה ועקבית; אם פעולה זו נכשלת, תנאי ההשריה משתנים בדרך כלל על ידי שינוי זמן ההשריה או ריכוז הממס. לאחר סינון מקדים מוצלח, ניתן להגדיר את שאר התרכובות שנבחרו לניסוי באמצעות הפרמטרים הסופיים.
ספריית DSI (ראו טבלת חומרים) תוכננה בכוונה לאפשר התקדמות מעקב מהירה באמצעות כימיה יציבה29 והייתה ספריית סוס העבודה של המתקן. הוא זמין למשתמשים בריכוז של 500 mM ב- DMSO. משתמשים אקדמיים יכולים גם לגשת לספריות אחרות המסופקות על ידי משתפי פעולה (מעל 2,000 תרכובות בסך הכל) בריכוזים של 100-500 מילימטר ב- DMSO (רשימה מלאה ניתן למצוא באתר28). חלק גדול מהאוסף הכולל זמין גם באתילן גליקול, עבור מערכות גבישיות שאינן סובלות DMSO. משתמשים יכולים גם להביא ספריות משלהם, בתנאי שהן נמצאות בצלחות התואמות למערכת הטיפול בנוזלים אקוסטיים (ראה טבלת חומרים).
עבור כל שלושת שלבי הניסוי (אפיון ממס, טרום מסך או מסך מלא), הליכי הכנת הדגימה הבאים זהים (איור 3): בחירת מיקום ניפוק התרכובת באמצעות הדמיה ומיקוד של טיפות התגבשות עם TeXRank22; ניפוק לטיפות באמצעות מערכת ניפוק נוזלים אקוסטית הן לממס והן לתרכובות23; קציר יעיל של הגבישים באמצעות מעביר קריסטל24; והעלאת מידע לדוגמה למסד הנתונים של Beamline (ISPyB). הממשק הנוכחי לתכנון וביצוע ניסויים הוא יישום מבוסס אקסל (SoakDB), אשר מייצר את קבצי הקלט הדרושים עבור הציוד השונים של הפלטפורמה, ועוקב ומתעד את כל התוצאות במסד נתונים SQLite. סורקי ברקוד משמשים בשלבים שונים לאורך התהליך כדי לסייע במעקב אחר דוגמאות ונתונים אלה מתווספים למסד הנתונים.
נתוני עקיפה נאספים במצב ללא השגחה באמצעות זמן אלומה ייעודי על קו האלומה I04-1. שני מצבי מרכוז זמינים, כלומר, אופטי ורנטגן מבוסס17. עבור גבישים בצורת מחט ומוט, מומלץ לבצע מרכוז קרני רנטגן, בעוד שגבישים גושים יותר תומכים בדרך כלל במצב אופטי, שהוא מהיר יותר ולכן מאפשר לאסוף יותר דגימות בזמן הקרן המוקצב. בהתאם לרזולוציה של הגבישים (שנקבעו לפני הכניסה לפלטפורמה), איסוף הנתונים יכול להיות חשיפה כוללת של 60 שניות או 15 שניות. איסוף נתונים בשלב בדיקת הממס בדרך כלל מודיע איזה שילוב יעבוד הכי טוב עם הביצועים של beamline I04-1.
הנפח הגדול של ניתוח הנתונים מנוהל באמצעות XChemExplorer (XCE)25, אשר יכול לשמש גם כדי להפעיל את שלב זיהוי הלהיטים באמצעות PanDDA26. XCE הוא כלי לניהול נתונים וזרימת עבודה שתומך בניתוח בקנה מידה גדול של מבני ליגנד חלבונים (איור 4); הוא קורא כל אחת מתוצאות העיבוד האוטומטי מנתונים שנאספו ב- Diamond Light Source (DIALS16, Xia214, AutoPROC30 ו- STARANISO31) ובוחר אוטומטית אחת מהתוצאות בהתבסס על איכות הנתונים ודמיון למודל ייחוס. חשוב שהמודל ייצג את המערכת הגבישית המשמשת לבדיקת XChem, ועליו לכלול את כל המים או מולקולות ממס אחרות, כמו גם את כל הקו-פקטורים, הליגנדות והקונפורמציות החלופיות הנראות בגבישים ספוגים בממס בלבד. איכותו של מודל ייחוס זה תשפיע ישירות על כמות העבודה הנדרשת בשלב בניית המודל ושכלולו. PanDDA משמש לניתוח כל הנתונים ולזיהוי אתרים מחייבים. הוא מיישר מבנים למבנה ייחוס, מחשב את המפות הסטטיסטיות, מזהה אירועים ומחשב מפות אירועים26,32. בפרדיגמת PanDDA, אין צורך או רצוי לבנות את המודל הקריסטלוגרפי המלא; מה שיש למדל הוא רק את נקודת המבט של החלבון שבו מקטע קשור (מודל מצב הכבול), ולכן ההתמקדות צריכה להיות רק בבניית הליגנד ומולקולות השאריות/ממס שמסביב על פי מפת האירועים32.
Protocol
Representative Results
Discussion
התהליך המתואר במאמר זה נבדק בהרחבה על ידי קהילת המשתמשים ויכולת ההסתגלות של הפרוטוקולים המתוארים כאן היא המפתח לטיפול במגוון הרחב של פרויקטים שבדרך כלל נתקלים בהם בפלטפורמה. עם זאת, יש צורך בכמה תנאים מוקדמים של מערכת הגביש.
עבור כל מסע סינון פרגמנטים המתבצע באמצעות קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן, מערכת גבישים ניתנת לשחזור וחזקה היא קריטית. מכיוון שפרוטוקול XChem הסטנדרטי כולל הוספה של המקטע ישירות לטיפת הגביש, המיטוב צריך להתמקד במספר הטיפות המכילות גבישים באיכות גבוהה ולא במספר הכולל של הגבישים. אם טיפות מכילות גבישים מרובים, אז הם למעשה מיותרים אם כי עשויים להקל על תהליך הקציר. יתר על כן, העברת פרוטוקול ההתגבשות מהמכון הביתי למתקנים באתר יכולה להיות מאתגרת. בדרך כלל הדרך הטובה ביותר להשיג זאת היא באמצעות זריעת גבישים כדי לקדם גרעין54 הניתן לשחזור, ולכן, נוהג טוב הוא שמשתמשים יספקו מלאי זרעים יחד עם פתרונות החלבונים וההתגבשות שלהם.
כדי להבטיח מסיסות ותמיכה טובה בתרכובת, ריכוזי ההשריה הגבוהים שנועדו להניע קשירה של מקטעים חלשים, ספריות המקטעים מסופקות בממסים אורגניים, במיוחד DMSO ואתילן גליקול. אספקה של שני ממסים שונים נותנת למשתמשים חלופה לגבישים שאינם סובלים DMSO כלל, או כאשר הוא מונע את קשירת השברים באתר מעניין. משתמשים יכולים לספק ספריות חלופיות בחיץ מימי: תרכובות יוותרו היטב בתנאי שהן מומסות לחלוטין ומעוצבות בלוחות התואמים לרובוט חלוקת הנוזלים.
בפרויקטים בהם לא ניתן למצוא ממס אורגני מתאים שגם יסיס את הספרייה וגם יהיה נסבל על ידי המערכת הגבישית, הליך חלופי הוא שימוש בתרכובות מיובשות כפי שנקבע ב- BESSY55.
בקהילה קיימת שאלה ארוכת שנים לגבי היכולת לספוג תרכובות לגבישים הגדלים בתנאי התגבשות המכילים ריכוזי מלח גבוהים. מעשית, יותר משקעים של תרכובות היווצרות מהירה של גבישי מלח בשלב הקציר הוא ציין, אשר מופחת על ידי החלת סביבה לחה סביב אזור הקציר. באופן כללי, מסעות סינון במערכות גבישיות מתנאי התגבשות מלח גבוהים נותנים שיעור פגיעה דומה לתנאי מלח נמוכים.
השלבים הראשונים של תהליך XChem (בדיקת סבילות לממס וטרום מסך) הם ניסויים בקנה מידה קטן יחסית ומהיר, אך מאפשרים החלטה ברורה של go/no go עבור הפרויקט. למרבה הכאב, יהיה צורך למצוא מערכות גבישים חלופיות אם אף אחד מהממסים אינו נסבל, או אם המסך המקדים גורם לשיעור פגיעות נמוך מאוד. לעומת זאת, אם הם מצליחים, התוצאות מודיעות ישירות על תנאי ההשריה לשימוש בניסוי הסינון, ועל האסטרטגיה הטובה ביותר לאיסוף נתונים. מכיוון שאיכות הנתונים, ובמיוחד הרזולוציה, ישפיעו על איכות צפיפות האלקטרונים לצורך זיהוי וניתוח פגיעות, המטרה היא להשרות בריכוז המורכב הגבוה ביותר האפשרי שאין לו השפעה מזיקה על איכות העקיפה (כאשר רוב מערכי הנתונים (~80%) עקיפה לרזולוציה של 2.8 Å ומעלה).
תהליך ניתוח הנתונים יעיל בתוך XChemExplorer, המסתמך על תוכנת PanDDA לזיהוי קלסרים חלשים ומאפשר למשתמשים לדמיין ולסקור במהירות את תוצאות קמפיין הסינון. XChemExplorer מייבאת תוצאות עיבוד נתונים מהחבילות הזמינות ב- Diamond (DIALS16, autoPROC 30, STARANISO31 ו- Xia214) עם מגבלות רזולוציה שנקבעו על ידי השיטה הסטנדרטית עבור כל חבילה (כלומר,CC1/2 = 0.3). כברירת מחדל, בחירת ערכת הנתונים מבוססת על ציון המחושב מ- I/sigI, שלמות ומספר השתקפויות ייחודיות, אך ניתן לבחור תוצאות עיבוד ספציפיות לשימוש הן באופן גלובלי והן עבור דגימות בודדות25. נתונים אינם נכללים גם בניתוח על ידי PanDDA בהתבסס על קריטריונים הכוללים רזולוציה,R free, והבדל בנפח תא היחידה בין נתוני ייחוס ויעד (ברירות המחדל הן 3.5 Å, 0.4 ו- 12% בהתאמה), כך שגבישים בעלי פיזור גרוע, מיקוד שגוי או אינדקס שגוי אינם משפיעים על הניתוח.
אלגוריתם PanDDA מנצל את המספר המשמעותי של מערכי נתונים שנאספו במהלך קמפיין פרגמנטים כדי לזהות ליגנדות תפוסה חלקיות שאינן נראות במפות קריסטלוגרפיות סטנדרטיות. בתחילה, PanDDA משתמשת בנתונים שנאספו במהלך בדיקת סבילות הממס ושלבי טרום המסך כדי להכין מפת צפיפות ממוצעת המשמשת לאחר מכן ליצירת מודל מצב קרקע. מכיוון שמודל זה ישמש לכל שלבי הניתוח הבאים, חיוני שהוא ייצג במדויק את החלבון הבלתי קשור בתנאים המשמשים למסך הפרגמנט. PanDDA משתמש בניתוח סטטיסטי כדי לזהות ליגנדות קשורות, ויוצר מפת אירועים עבור המצב הכבול של הגביש. מפת אירועים נוצרת על ידי חיסור החלק הלא מאוגד של הגביש ממערך הנתונים של התפוסה החלקית ומציגה מה היה נצפה אם הליגנד היה קשור בתפוסה מלאה. אפילו קטעים שנראים ברורים במפות 2mFo-DF c רגילות עלולים להיות במודל שגוי אם לא מתייעצים במפות האירועים32. בעוד PanDDA היא שיטה רבת עוצמה לזיהוי מערכי נתונים השונים מהמפות הממוצעות (המעידות בדרך כלל על קשירת מקטעים) ומדדים כגון RSCC, RSZD, יחס גורם B ו- RMSD במהלך העידון מסופקים לטובת המשתמשים, המשתמש אחראי בסופו של דבר להחליט אם הצפיפות הנצפית מתארת במדויק את הליגנד הצפוי ואת הקונפורמציה המתאימה ביותר.
לאחר ניתוח נתונים ושכלולם, כל המשתמשים יכולים להפקיד בו זמנית מבנים מרובים בבנק נתוני החלבונים (PDB) באמצעות XChemExplorer. עבור כל מסך פרגמנט, שני תצהירים קבוצתיים נעשים. התצהיר הראשון מכיל את כל המודלים הקשורים למקטעים, עם מקדמים לחישוב מפות אירועים של PanDDA הכלולים בקבצי MMCIF. התצהיר השני מספק את מודל מצב הקרקע הנלווה, לאורך גורמי המבנה הנמדדים של כל מערכי הנתונים של הניסוי: נתונים אלה יכולים לשמש לשחזור ניתוח PanDDA, ולפיתוח אלגוריתמים עתידיים. באשר למבנים של הלהיטים, כאשר תפוסת הפרגמנטים נמוכה, העידון מתנהג טוב יותר אם המודלים מורכבים ממבני הקרקע הקשורים לליגנד ומבלבלים32; עם זאת, הנוהג הוא להפקיד רק את שברי המצב הכבול, שכן המודלים המרוכבים המלאים הם בדרך כלל מורכבים וקשים לפרשנות. כתוצאה מכך, כמה מחווני איכות המחושבים מחדש על ידי PDB (בפרט, R/Rfree) הם לפעמים מעט מוגבהים. ניתן גם לספק את כל הנתונים הגולמיים באמצעות פלטפורמות כגון Zenodo56, אם כי זה לא נתמך כרגע על ידי צינור XChem.
בסך הכל, מאז הפעלתו בשנת 2016, ניתן היה לזהות ליגנדות מקטעים ביותר מ-95% מהמטרות באמצעות הליך זה. הניסיון מהפרויקטים הרבים ש-XChem תמכה בהם זוקק לשיטות עבודה מומלצות להכנת קריסטלים33, בעוד שפותחה ספריית פרגמנטים שיישמה את הרעיון המוכן לסיוע בהתקדמות פרגמנט29, וגם עזרה לבסס את הפרקטיקה של הפיכת קומפוזיציית הספרייה לציבורית. הפלטפורמה הדגימה את החשיבות של תשתית מתוחזקת היטב ותהליכים מתועדים, המפורטים כאן, ואפשרה להעריך ספריות פרגמנטים אחרות 57,58, להשוות ספריות48, וליידע את העיצוב של ספריית EUOpenscreen-DRIVEהשיתופית 59,60.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מייצגת מאמץ משותף גדול בין מקור אור היהלום לבין קונסורציום גנומי המבנה. המחברים רוצים להודות לקבוצות התמיכה השונות של Diamond ולקבוצת MX על תרומתן לאוטומציה של i04-1 beamline ועל אספקת צינורות יעילים לאיסוף נתונים ועיבוד אוטומטי, אשר בדרך כלל רצים על פני כל אלומות MX. הם גם רוצים להודות לקבוצת SGC PX על עמידותם כמשתמשים הראשונים שבדקו את ההתקנה ול- Evotec על היותם המשתמשים התעשייתיים הרציניים הראשונים. עבודה זו נתמכה על ידי iNEXT-Discovery (מענק 871037) שמומן על ידי תוכנית Horizon 2020 של הנציבות האירופית.
Materials
| DSI-poised library | Enamine | DSI-896 | fragment library |
| Echo 550 and 650 series | Beckman-Coulter | acoustic dispensing system | |
| Echo microplates | Beckman-Coulter | 001-12380; 001-8768; 001-6025 | 1536-well and 384-well microplates |
| Shifter | Oxford Lab Technology | harvesting device | |
| Microplate centrifuge with a swing-out rotor | Sigma | model 11121 | microplate centrifuge |
| 3-drops crystallisation plates | Swissci | 3W96T-UVP | Crystallisation plates |
| Formulatrix plate imager and Rockmaker software | Formulatrix | Crystallisation plates imaging device |
References
- Erlanson, D. A., Fesik, S. W., Hubbard, R. E., Jahnke, W., Jhoti, H. Twenty years on: The impact of fragments on drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 15 (9), 605-619 (2016).
- Jacquemard, C., Kellenberger, E. A bright future for fragment-based drug discovery: what does it hold. Expert Opinion on Drug Discovery. 14 (5), 413-416 (2019).
- Jahnke, W., et al. Fragment-to-lead medicinal chemistry publications in 2019. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (24), 15494-15507 (2019).
- Li, Q. Application of fragment-based drug discovery to versatile targets. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 180 (2020).
- Kirsch, P., Hartman, A. M., Hirsch, A. K. H., Empting, M. Concepts and core principles of fragment-based drug design. Molecules. 24 (23), 4309 (2019).
- Patel, D., Bauman, J. D., Arnold, E. Advantages of crystallographic fragment screening: functional and mechanistic insights from a powerful platform for efficient drug discovery. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 116 (2-3), 92-100 (2014).
- Wasserman, S., et al. Automated synchrotron crystallography for drug discovery: the LRL-CAT beamline at the APS. Acta Crystallographica Section A Foundations of Crystallography. 67 (1), 46-47 (2011).
- Hartshorn, M. J. Fragment-based lead discovery using X-ray crystallography. Journal of Medicinal Chemistry. 48 (2), 403-413 (2005).
- Arzt, S., et al. Automation of macromolecular crystallography beamlines. Progress in Biophysics and Molecular Biology. 89 (2), 124-152 (2005).
- Beteva, A. High-throughput sample handling and data collection at synchrotrons: Embedding the ESRF into the high-throughput gene-to-structure pipeline. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 62, 1162-1169 (2006).
- Papp, G., et al. FlexED8: The first member of a fast and flexible sample-changer family for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, 841-851 (2017).
- Casanas, A., et al. EIGER detector: Application in macromolecular crystallography. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 72, 1036-1048 (2016).
- Henrich, B., et al. PILATUS: A single photon counting pixel detector for X-ray applications. Nuclear Instruments and Methods in Physics Research, Section A: Accelerators, Spectrometers, Detectors and Associated Equipment. 607 (1), 247-249 (2009).
- Winter, G., Lobley, C. M. C., Prince, S. M. Decision making in xia2. Acta Crystallographica Section D, Biological Crystallography. 69, 1260-1273 (2013).
- Winter, G., McAuley, K. E. Automated data collection for macromolecular crystallography. Methods. 55 (1), 81-93 (2011).
- Winter, G., et al. DIALS: Implementation and evaluation of a new integration package. Acta Crystallographica Section D, Structural Biology. 74, 85-97 (2018).
- Bowler, M. W. MASSIF-1: A beamline dedicated to the fully automatic characterization and data collection from crystals of biological macromolecules. Journal of Synchrotron Radiation. 22 (6), 1540-1547 (2015).
- Von Stetten, D., et al. ID30A-3 (MASSIF-3) – A beamline for macromolecular crystallography at the ESRF with a small intense beam. Journal of Synchrotron Radiation. 27, 844-851 (2020).
- Cipriani, F., et al. CrystalDirect: a new method for automated crystal harvesting based on laser-induced photoablation of thin films. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 68, 1393-1399 (2012).
- . Helmholtz Zentrum Berlin Available from: https://www.helmholtzberlin.de/forschung/oe/np/gmx/fragment-screening/index_en.html (2021)
- Lima, G. M. A., et al. FragMAX: the fragment-screening platform at the MAX IV Laboratory. Acta crystallographica. Section D, Structural biology. 76 (8), 771-777 (2020).
- Ng, J. T., Dekker, C., Kroemer, M., Osborne, M., Von Delft, F. Using textons to rank crystallization droplets by the likely presence of crystals. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 70, 2702-2718 (2014).
- Collins, P. M., et al. Gentle, fast and effective crystal soaking by acoustic dispensing. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, 246-255 (2017).
- Wright, N. D., et al. The low-cost Shifter microscope stage transforms the speed and robustness of protein crystal harvesting. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 77, 62-74 (2021).
- Krojer, T., et al. The XChemExplorer graphical workflow tool for routine or large-scale protein-ligand structure determination. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, 267-278 (2017).
- Pearce, N. M., et al. A multi-crystal method for extracting obscured crystallographic states from conventionally uninterpretable electron density. Nature Communications. 8, 15123 (2017).
- . Fragalysis Available from: https://fragalysis.diamond.ac.uk (2021)
- . Diamond Light Source Ltd Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Fragment-Screening.html (2021)
- Cox, O. B., et al. A poised fragment library enables rapid synthetic expansion yielding the first reported inhibitors of PHIP(2), an atypical bromodomain. Chemical Science. 7 (3), 2322-2330 (2016).
- Vonrhein, C., et al. Data processing and analysis with the autoPROC toolbox. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 67, 293-302 (2011).
- Vonrhein, C., et al. Advances in automated data analysis and processing within autoPROC , combined with improved characterisation, mitigation and visualisation of the anisotropy of diffraction limits using STARANISO. Acta Crystallographica Section A: Foundations and Advances. 74 (1), 360 (2018).
- Pearce, N. M., Krojer, T., Von Delft, F. Proper modelling of ligand binding requires an ensemble of bound and unbound states. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, 265-266 (2017).
- Collins, P. M., et al. Achieving a good crystal system for crystallographic x-ray fragment screening. Methods in Enzymology. 610, 251-264 (2018).
- Delageniere, S., et al. ISPyB: an information management system for synchrotron macromolecular crystallography. Bioinformatics. 27 (22), 3186-3192 (2011).
- Fisher, S. J., Levik, K. E., Williams, M. A., Ashton, A. W., McAuley, K. E. SynchWeb: a modern interface for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 48, 927-932 (2015).
- Ginn, H. M., et al. SynchLink: an iOS app for ISPyB. Journal of Applied Crystallography. 47, 1781-1783 (2014).
- . Diamond Light Source Ltd Available from: https://www.diamond.ac.uk/Instruments/Mx/Common/Common-Manual/Data-Analysis/Reprocessing-in-ISPyB.html (2021)
- Wojdyr, M., Keegan, R., Winter, G., Ashton, A. DIMPLE – a pipeline for the rapid generation of difference maps from protein crystals with putatively bound ligands. Acta Crystallographica. Section A, Foundations of Crystallography. 69, 299 (2013).
- Long, F., et al. AceDRG: A stereochemical description generator for ligands. Acta Crystallographica. Section D, Structural Biology. 73, 112-122 (2017).
- Moriarty, N. W., Grosse-Kunstleve, R. W., Adams, P. D. Electronic ligand builder and optimization workbench (eLBOW): A tool for ligand coordinate and restraint generation. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 65, 1074-1080 (2009).
- Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W. G., Cowtan, K. Features and development of Coot. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, 486-501 (2010).
- Murshudov, G. N., Vagin, A. A., Dodson, E. J. Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 53, 240-255 (1997).
- Bricogne, G., et al. Buster version 2.10.3. Global Phasing Ltd. , (2017).
- Chen, V. B., et al. MolProbity: All-atom structure validation for macromolecular crystallography. Acta Crystallographica. Section D, Biological Crystallography. 66, 12-21 (2010).
- Bruno, I. J., et al. Retrieval of crystallographically-derived molecular geometry information. Journal of Chemical Information and Computer Sciences. 44 (6), 2133-2144 (2004).
- Delbart, F., et al. An allosteric binding site of the α7 nicotinic acetylcholine receptor revealed in a humanized acetylcholine-binding protein. TheJournal of Biological Chemistry. 293, 2534-2545 (2018).
- Douangamath, A., et al. Crystallographic and electrophilic fragment screening of the SARS-CoV-2 main protease. Nature Communications. 11 (1), 5047 (2020).
- Guo, J., et al. In crystallo-screening for discovery of human norovirus 3C-like protease inhibitors. Journal of Structural Biology: X. 4, 100031 (2020).
- Keedy, D. A., et al. An expanded allosteric network in PTP1B by multitemperature crystallography, fragment screening, and covalent tethering. eLife. 7, 36307 (2018).
- McIntyre, P. J., et al. Characterization of three druggable hot-spots in the aurora-a/tpx2 interaction using biochemical, biophysical, and fragment-based approaches. ACS Chemical Biology. 12 (11), 2906-2914 (2017).
- Thomas, S. E., et al. Structure-guided fragmentbased drug discovery at the synchrotron: Screening binding sites and correlations with hotspot mapping. Philosophical Transactions. Series A, Mathematical, Physical and Engineering Sciences. 377 (2147), 20180422 (2019).
- Nichols, C., et al. Mining the PDB for tractable cases where x-ray crystallography combined with fragment screens can be used to systematically design protein-protein inhibitors: Two test cases illustrated by IL1β-IL1R and p38α-TAB1 complexes. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (14), 7559-7568 (2020).
- D’Arcy, A., Bergfors, T., Cowan-Jacob, S. W., Marsh, M. Microseed matrix screening for optimization in protein crystallization: What have we learned. Acta Crystallographica. Section F, Structural Biology Communications. 70, 1117-1126 (2014).
- Wollenhaupt, J., et al. F2X-Universal and F2X-Entry: Structurally diverse compound libraries for crystallographic fragment screening. Structure. 28 (6), 694-706 (2020).
- . Zenodo Available from: https://zenodo.org (2021)
- Foley, D. J., et al. Synthesis and demonstration of the biological relevance of sp(3) -rich scaffolds distantly related to natural product frameworks. 화학. 23 (60), 15227-15232 (2017).
- Kidd, S. L., et al. Demonstration of the utility of DOS-derived fragment libraries for rapid hit derivatisation in a multidirectional fashion. Chemical Science. 11 (39), 10792-10801 (2020).
- . EU-openscreen ERIC Available from: https://www.eu-openscreen.eu/ (2021)
- Schuller, M., et al. Fragment binding to the Nsp3 macrodomain of SARS-CoV-2 identified through crystallographic screening and computational docking. bioRxiv. 393405, (2020).
