Peptit Matrisi Bazlı HLA-DR-Restricted CD4 T-Cell Epitoplarının HBV'ye Özgü CD4 T hücre yanıtlarının analizi ve tanımlanması
Summary
Hepatit B virüsü (HBV) türevi peptit matrisi baz alınarak, HBV’ye özgü CD4 T hücre yanıtları HBV’ye özgü CD4 T hücreli epitopların tanımlanmasına paralel olarak değerlendirilebilir.
Abstract
CD4 T hücreleri kronik hepatit B patogenezinde önemli roller oynar. Çok yönlü bir hücre popülasyonu olarak, CD4 T hücreleri salgıladıkları sitokinlere göre farklı fonksiyonel alt kümeler olarak sınıflandırılmıştır: örneğin, CD4 T yardımcı 1 hücreleri için IFN-γ, CD4 T yardımcı 2 hücreleri için IL-4 ve IL-13, CD4 T foliküler yardımcı hücreler için IL-21 ve CD4 T yardımcı 17 hücre için IL-17. Hepatit B virüsüne (HBV) özgü CD4 T hücrelerinin HBV türevi peptit stimülasyonundan sonra sitokin salgısına dayalı analizi, sadece HBV’ye özgü CD4 T hücre yanıtının büyüklüğü hakkında değil, aynı zamanda HBV’ye özgü CD4 T hücrelerinin fonksiyonel alt kümeleri hakkında da bilgi sağlayabilir. Transkriptomik ve metabolomik analiz gibi yeni yaklaşımlar, HBV’ye özgü CD4 T hücreleri hakkında daha ayrıntılı işlevsel bilgiler sağlayabilir. Bu yaklaşımlar genellikle peptit majör histocompatibility complex-II multimers baz alınarak uygulanabilir HBV’ye özgü CD4 T hücrelerinin izolasyonunu gerektirirken, şu anda HBV’ye özgü CD4 T hücreli epitoplar hakkındaki bilgiler sınırlıdır. HBV türevi peptit matrisine dayanarak, kronik HBV enfeksiyonu hastalarından periferik kan mononükleer hücre örnekleri kullanılarak HBV’ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmek ve HBV’ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamak için bir yöntem geliştirilmiştir.
Introduction
Şu anda antijene özgü T hücrelerini analiz etmek için 3 ana yaklaşım bulunmaktadır. İlk yaklaşım, T hücre reseptörü ile peptit (epitop) arasındaki etkileşime dayanır. Antijene özgü T hücreleri doğrudan peptit-majör histocompatibility complex (MHC) multimerleri ile boyanabilir. Bu yöntemin avantajı, aşağı akış transkriptomik / metabolomik analizi için uygun canlı antijene özgü T hücreleri elde etmenindir. Bu yöntemin bir sınırlaması, belirli bir antijen için tanımlanmış epitopların sayısı şimdilik sınırlıyken, doğrulanmış epitop peptitleri gerektirdiğinden, belirli bir antijene tüm T hücresi yanıtı hakkında bilgi sağlayamamış olmasıdır. Hepatit B virüsüne (HBV) özgü CD8 T hücreli epitoplarla karşılaştırıldığında, HBV’ye özgü CD4 T hücre epitopları1,2olaraktanımlanmıştır,bu da bu yöntemi şu anda HBV’ye özgü CD4 T hücrelerinin analizi için daha az uygulanabilir hale getirmiştir.
İkinci yaklaşım, antijen peptit stimülasyonundan sonra bir dizi aktivasyon kaynaklı belirtecin yukarı doğrulasyonuna dayanır3. Yaygın olarak kullanılan belirteçler CD69, CD25, OX40, CD40L, PD-L1, 4-1BB4’leriiçerir. Bu yöntem artık aşılanmış bireylerde antijene özgü T hücre yanıtlarını analiz etmek için kullanılmıştır5,6, İnsan İmmün Yetmezlik Virüs enfeksiyonu hastaları7ve Şiddetli Akut Solunum Sendromu Koronavirüs 2 enfeksiyon hastaları8,9. Peptit-MHC multimers bazlı testlerin aksine, bu yöntem doğrulanmış epitoplar tarafından kısıtlanmamıştır ve aşağı akış analizi için uygulanabilir hücreler elde edebilir. Bu yöntemin bir sınırlaması, antijene özgü T hücrelerinin sitokin profili hakkında bilgi sağlayamamasıdır. Ayrıca, bu aktivasyon kaynaklı belirteçlerin bazı aktif antijen içermeyen hücreler tarafından ifade edilmesi, analizdeki arka plan sinyallerine katkıda bulunabilir, bu da özellikle hedef antijene özgü T hücreleri nadir olduğunda bir sorun olabilir. Şu anda, bu yöntemin HBV’ye özgü CD4 T hücreleri4üzerinde sınırlı uygulanması vardır. Bu yöntemin HBV’ye özgü CD4 T hücrelerini güvenilir bir şekilde analiz etmek için kullanılıp kullanılamayacağı daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyar.
Üçüncü yaklaşım antijen peptit stimülasyonundan sonra sitokin salgısına dayanır. Aktivasyon kaynaklı işaret tabanlı analiz gibi, bu yöntem de doğrulanmış epitoplar tarafından kısıtlanmamıştır. Bu yöntem antijene özgü T hücrelerinin sitokin profilini doğrudan ortaya çıkardı. Bu yöntemin hassasiyeti, antijene özgü T hücrelerinin sitokin salgılanmasına dayandığı ve test edilen sitokin sayısı genellikle sınırlı olduğu için aktivasyon kaynaklı belirteç bazlı yöntemden daha düşüktür. Şu anda, bu yöntem HBV’ye özgü T hücrelerinin analizinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Sitokin salgılayan HBV’ye özgü T hücreleri doğrudan ex vivo peptid stimülasyonu ile neredeyse tespit edilemediğinden10,11, HBV’ye özgü T hücrelerinin sitokin profili genellikle 10 günlük in vitro peptidin uyarılmış genişlemesi12 , 13,14,15,16‘dan sonra analiz edilir. Peptit havuzlarının matris formunda düzenlenmesi, antijene özgü epitopların tanımlanmasını kolaylaştırmak için kullanılmıştır17,18. Peptit matrisi ve sitokin salgı analizinin kombinasyonu ile HBV’ye özgü CD4 T hücre yanıtlarını değerlendirmek ve HBV’ye özgü CD4 T hücre epitoplarını aynı anda tanımlamak için bir yöntem geliştirilmiştir16. Bu protokolde, bu yöntemin ayrıntıları açıklanmıştır. HBV çekirdek antijeni bu protokolde bir gösteri örneği olarak seçilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokoldeki en kritik adımlar şu şekilde listelenmiştir: 1) PBMC genişlemesini başlatmak için yeterli yüksek uygulanabilirlik PBMC’leri; 2) PBMC genişlemesi için uygun ortam; ve 3) EPITOP TANıMLAMASINDAN ÖNCE PBMC kültüründe artık peptit havuzlarının tamamen çıkarılması.
Bu protokoldeki tüm analizler CD4 T hücrelerinin sağlam çoğalmasına bağlıdır. Genel olarak, 10 günlük genişlemeden sonra PBMC sayısı ilk sayının 2-3 katı olacaktır. PBMC’lerin hücre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81930061), Chongqing Doğa Bilimleri Vakfı (cstc2019jcyj-bshX0039, cstc2019jcyj-zdxmX0004) ve Chinese Key tarafından desteklenmiştir.
Enfeksiyon Hastalıkları için Uzmanlaşmış Proje (2018ZX10723203).
Materials
| Albumin Bovine V (BSA) | Beyotime | ST023 | |
| APC-conjugated Anti-human TNF-α | eBioscience | 17-7349-82 | Keep protected from light |
| Benzonase Nuclease | Sigma-Aldrich | E1014 | Limit cell clumping |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09126 | HLA-DRB1*0803 homozygote |
| B lymphoblastoid cell lines (BLCLs) | FRED HUTCHINSON CANCER RESEARCH CENTER | IHW09121 | HLA-DRB1*1202 homozygote |
| Cell Culture Flask (T75) | Corning | 430641 | |
| Cell Culture Plate (96-well, flat bottom) | Corning | 3599 | Flat bottom |
| Cell Culture Plate (96-well, round bottom) | Corning | 3799 | Round bottom |
| Cell Strainer | Corning | CLS431751 | Pore size 70 μm, white, sterile |
| Centrifuge Tube (15 mL) | KIRGEN | KG2611 | Sterile |
| Centrifuge Tube (50 mL) | Corning | 430829 | Sterile |
| Centrifuge, Refrigerated | Eppendorf | 5804R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | ST16R | |
| Centrifuge, Refrigerated | Thermo | Legend Micro 21R | |
| Cytofix/Cytoperm Kit (Transcription Factor Buffer Set) | BD Biosciences | 562574 | Prepare solution before use |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | Keep at room temperature to prevent crystallization |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Prepare ddH2O (1000 ml) containing NaCl (8000 mg), KCl (200 mg), KH2PO4 (200 mg), and Na2HPO4.7H2O (2160 mg). Adjust PH to 7.4. Sterilize through autoclave. | ||
| Ficoll-Paque Premium | GE Healthcare | 17-5442-03 | |
| Filter Tips (0.5-10) | Kirgen | KG5131 | Sterile |
| Filter Tips (100-1000) | Kirgen | KG5333 | Sterile |
| Filter Tips (1-200) | Kirgen | KG5233 | Sterile |
| FITC-conjugated Anti-human CD4 | BioLegend | 300506 | Keep protected from light |
| Fixable Viability Dye eFluor780 | eBioscience | 65-0865-14 | Keep protected from light |
| GolgiStop Protein Transport Inhibitor (Containing Monensin) | BD Biosciences | 554724 | Protein Transport Inhibitor |
| Haemocytometer | Brand | 718620 | |
| HBV Core Antigen Derived Peptides | ChinaPeptides | ||
| HEPES | Gibco | 15630080 | 100 ml |
| Human Serum AB | Gemini Bio-Products | 100-51 | 100 ml |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| KCl | Sangon Biotech | A100395-0500 | |
| KH2PO4 | Sangon Biotech | A100781-0500 | |
| LSRFortessa Flow Cytometer | BD | ||
| L-glutamine | Gibco | 25030081 | 100 ml |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mL) | Corning | MCT-150-C | Autoclaved sterilization before using |
| Microplate Shakers | Scientific Industries | MicroPlate Genie | |
| Mitomycin C | Roche | 10107409001 | |
| Na2HPO4.7H2O | Sangon Biotech | A100348-0500 | |
| NaCl | Sangon Biotech | A100241-0500 | |
| PCR Tubes (0.2 mL) | Kirgen | KG2331 | |
| PE/Cy7-conjugated Anti-human CD8 | BioLegend | 300914 | Keep protected from light |
| PE-conjugated Anti-human IFN-γ | eBioscience | 12-7319-42 | Keep protected from light |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140122 | 100 ml |
| PerCP-Cy5.5-conjugated Anti-human CD3 | eBioscience | 45-0037-42 | Keep protected from light |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Sigma-Aldrich | P1585 | |
| Recombinant Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | |
| Recombinant Human IL-7 | PeproTech | 200-07 | |
| RPMI Medium 1640 | Gibco | C11875500BT | 500 ml |
| Sodium pyruvate,100mM | Gibco | 15360070 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
| Ultra-LEAF Purified Anti-human HLA-DR | BioLegend | 307648 | |
| Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1125 |
References
- Desmond, C. P., Bartholomeusz, A., Gaudieri, S., Revill, P. A., Lewin, S. R. A systematic review of T-cell epitopes in hepatitis B virus: identification, genotypic variation and relevance to antiviral therapeutics. Antiviral Therapy. 13, 161-175 (2008).
- Mizukoshi, E., et al. Cellular immune responses to the hepatitis B virus polymerase. Journal of Immunology. 173, 5863-5871 (2004).
- Wölfl, M., Kuball, J., Eyrich, M., Schlegel, P. G., Greenberg, P. D. Use of CD137 to study the full repertoire of CD8+ T cells without the need to know epitope specificities. Cytometry Part A. 73, 1043-1049 (2008).
- Reiss, S., et al. Comparative analysis of activation induced marker (AIM) assays for sensitive identification of antigen-specific CD4 T cells. PLoS One. 12, 0186998 (2017).
- Herati, R. S., et al. Successive annual influenza vaccination induces a recurrent oligoclonotypic memory response in circulating T follicular helper cells. Science Immunology. 2, (2017).
- Bowyer, G., et al. Activation-induced Markers Detect Vaccine-Specific CD4+ T Cell Responses Not Measured by Assays Conventionally Used in Clinical Trials. Vaccines. 6, (2018).
- Morou, A., et al. Altered differentiation is central to HIV-specific CD4(+) T cell dysfunction in progressive disease. Nature Immunology. 20, 1059-1070 (2019).
- Grifoni, A., et al. Targets of T Cell Responses to SARS-CoV-2 Coronavirus in Humans with COVID-19 Disease and Unexposed Individuals. Cell. 181, 1489-1501 (2020).
- Meckiff, B. J., et al. Imbalance of Regulatory and Cytotoxic SARS-CoV-2-Reactive CD4+ T Cells in COVID-19. Cell. , (2020).
- Boni, C., et al. Characterization of hepatitis B virus (HBV)-specific T-cell dysfunction in chronic HBV infection. Journal of Virology. 81, 4215-4225 (2007).
- Chang, J. J., et al. Reduced hepatitis B virus (HBV)-specific CD4+ T-cell responses in human immunodeficiency virus type 1-HBV-coinfected individuals receiving HBV-active antiretroviral therapy. Journal of Virology. 79, 3038-3051 (2005).
- Boni, C., et al. Restored Function of HBV-Specific T Cells After Long-term Effective Therapy With Nucleos(t)ide Analogues. Gastroenterology. 143, 963-973 (2012).
- Kennedy, P. T., et al. Preserved T-cell function in children and young adults with immune-tolerant chronic hepatitis B. Gastroenterology. 143, 637-645 (2012).
- de Niet, A., et al. Restoration of T cell function in chronic hepatitis B patients upon treatment with interferon based combination therapy. Journal of Hepatology. 64, 539-546 (2016).
- Rinker, F., et al. Hepatitis B virus-specific T cell responses after stopping nucleos(t)ide analogue therapy in HBeAg-negative chronic hepatitis B. Journal of Hepatology. 69, 584-593 (2018).
- Wang, H., et al. TNF-α/IFN-γ profile of HBV-specific CD4 T cells is associated with liver damage and viral clearance in chronic HBV infection. Journal of Hepatology. 72, 45-56 (2020).
- Hoffmeister, B., et al. Mapping T cell epitopes by flow cytometry. Methods. 29, 270-281 (2003).
- Anthony, D. D., Lehmann, P. V. T-cell epitope mapping using the ELISPOT approach. Methods. 29, 260-269 (2003).
