D1S80ローカスを用いたDNAフィンガープリントのラボクラスへの応用

注:このプロトコルは、ジェノティピックプロファイルが遺伝的関係に関する洞察を与えるため、学生またはそれぞれの法的保護者がこのプロトコルの実施に同意した場合にのみ使用されます。DNAフィンガープリントは、主に集団研究や法医学に適用される一般的な分子生物学方法です。したがって、汚染リスクを可能な限り低く保つために注意を払う必要があります。外部ソースまたはDNasesからのDNAによるサンプルの汚染を避けるために、手袋を着用し、器具を十分に洗浄または滅菌し、使用前にフィルター滅菌またはオートクレーブする必要があります。 1. 頬粘膜上皮細胞の収穫 注意:唾液や上皮細胞を使用すると、感染症の伝染につながる可能性があります。したがって、標準および送信ベースの予防措置(例えば、適切な個人用保護具の使用)を適用する必要があります。 注:インストラクターによって提供され、下流の処理手順に含まれる肯定的なコントロール(例えば、インストラクターによって抽出されたDNA)を含めます。 標本採取前に歯を食べたり磨いたりした後、少なくとも1時間待ちます。 空の無菌2.0 mLマイクロ遠心チューブにラベルを付けます。 パッケージから1つの無菌頬綿棒を取り出し、頬の内側を30〜40回または30〜40秒間激しくこすり、頬粘膜上皮細胞を収穫します。 コレクションの先端を以前にラベル付けされた無菌マイクロ遠心分離チューブに入れ、手または滅菌はさみを使用して、端を越えて伸びるプラスチックの長さを断ち切ります。 キャップをチューブの上にしっかりと置き、コレクションの綿棒を内側に密封します。 ヒト細胞からのゲノムDNAの抽出 抽出前に、サンプル溶出のためにサーマルミキサーまたは加熱ブロックを65°Cに設定します。注意: 使用される化学物質の中には、危険な化学物質が分類されるものもあります。安全データシートをよく読み、取扱う前に適切な安全対策を講じてください。 すべての必要なバッファーおよび溶液(溶解液、8 M酢酸カリウム、2-プロパノール、70%エタノールおよび溶出バッファー)を濾過またはオートクレーブして調製し、滅菌します。注:すべての遠心段階は、指定されていない限り、室温(20〜30°C)で行う必要があります。 500 μL の溶解液(50 mM Tris/HCl、pH 8.0;10 mM エチレンジアミンテトラ酢酸(EDTA)、2%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS))をバッカス綿棒に加え、サンプルが溶解溶液に完全に浸漬されていることを確認します。 渦は少なくとも5sのために精力的に。 サーマルミキサーでサンプルを65°Cで10分間インキュベートします。 インキュベーション中に5sのパルス渦によってサンプルを3〜4回混合する。 リシスバッファーから綿棒を取り出し、綿棒をチューブの内側に押し付けて最大サンプル量を得る。 8 M酢酸カリウムの100 μLを、細胞を分解します。 白い沈殿物が出るまでチューブを反転して十分に混ぜます。 室温で5分間インキュベートします。 サンプルを18,000 x gで5分間遠心分離します。 450 μLの上清を清潔で無菌の1.5 mLマイクロ遠心チューブに移します。 450 μLの2-プロパノールを加え、チューブを反転(DNAの沈殿)して十分に混ぜます。 室温で5分間インキュベートします。 18,000 x gで 5 分間の遠心分離機 . 上清を捨て、きれいなペーパータオルでチューブを反転させてペレットを乾燥させ、クロスコンタミネーションを避けます。 65°Cで5分間、加熱ブロックでDNAをインキュベートし、ペレットを完全に乾燥させます。 DNAを洗浄するには、500 μLの70%エタノールを加えます。 18,000 x gで1分間の遠心分離機。 上清を捨て、きれいなペーパータオルでチューブを反転させてペレットを乾燥させます。 30 μL のリサスペンション バッファー(10 mM トリス/HCl pH 8.0、1 mM EDTA)をペレットに加えます。 DNasesを不活性化するために、65°CでDNAを65°Cで10分間インキュベートします。 PCRを用いた D1S80 VNTR遺伝子座の増幅 注:使用されるサンプルの数を記録し、必要なプラスチックやその他の材料を収集する前に、必要な試薬とそのボリュームでワークシートを準備します。PCR に使用する滅菌チューブ/ストリップ/プレートにサンプル番号を付けてラベルを付けます。PCRを検証するために、DNAの代わりにH2Oを用いた陰性コントロールと陽性対照(例えば、インストラクターが提供するDNAを使用)を含める必要があります。 10 μLの5x PCR反応バッファー(15 mM MgCl2を含む)、デオキシリボヌクレオチド三リン酸(dNtPs)(10 mM)の1 μL、各プライマーpMCT118-fおよびpMCT118-r(前方- 5′-GAACTGGCcCCAACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC 逆 – 5′-GTCTGTTGGAGATGCACGTGCGCTTGC-3′)Kasaiらによると、超純粋なH2Oの23.8 μL、およびTaq DNAポリメラーゼの0.2 μL(5 U/μL)。注:プライマーpMCT118-f/pMCT118-rは 、D1S80 VNTR領域の側面領域に設計され、全遺伝子座を増幅しました。 PCR チューブ/ストリップ/プレートに、使用するサンプル番号を付けます。 マスターミックスのアリコート45μLは、各標識PCRサンプルチューブまたはウェルに対する。 各PCRチューブ/プレートウェルのマスターミックスに5μLのDNAテンプレートを追加して、合計体積50μLを取得します。 DNAの代わりに超純粋なH2Oを用いて、テンプレートなし制御(NTC)を含める。 PCRチューブ/ストリップまたはシールプレートを閉じて混ぜます。 卓上遠心分離機を使用して、PCRチューブ/ストリップ/プレートを20s用に遠心分離します。注:このプロトコルで与えられたPCR条件は、DNAポリメラーゼおよび使用されるPCRサーマルサイクラーを使用して最適化されました。一般に、PCR条件はDNAポリメラーゼに適合する必要があります。Taq DNAポリメラーゼの標準延長時間は1分/kbです。 サンプルチューブ/ストリップ/プレートをサーモサイクラーに入れ、次の条件(DNAポリメラーゼ延長時間)を使用して反応をインキュベートします:95 °Cの1サイクル(2分間)。94°Cの25サイクル15s、60°C(15s)、72°C(30s)72°Cの1サイクル10分間。 プログラムが完了したら、サーモサイクラーから製品を取り出し、電気泳動まで一晩4°Cまたは-20 °Cで保管してください。 4. PCR産物のアガロースゲル電気泳動 1.5%のアガロースゲルを調製します。 アガロース粉末1.5gを使用し、フラスコに1xトリス酢酸EDTA(TAE)緩衝液100mLと混合します。 電子レンジ(600W)で約1.5〜2分間加熱します。内容物を旋回し、必要に応じて再び加熱し、アガロースを完全に溶解する。少し冷やして、アガロースにペクグリーンの2μLを加えます。 すべてのサンプルに十分なウェルを備えた櫛を使用してゲルをフォームに注ぎ、少なくとも1つの分子量マーカーを追加します。注意: 煮沸遅滞が発生する場合があります。まだ溶けていないアガロースを再懸濁する際には、フラスコを慎重に振ります。注:PeqGreenは核酸の検出のための無毒な染料です。これは、二本鎖DNA(dsDNA)および一本鎖DNA(ssDNA)、RNAの染色に適用できます。感度は臭化エチジウムに匹敵する。 PCR製品を4°Cから取り出し、遠心分離機を約10sで取り除きます。 ゲルのウェルを10 μLサンプルでロードします。ゲルを過負荷にしないでください。注:DNAポリメラーゼバッファーには、サンプル密度を高める化合物も含まれており、サンプルは負荷染料を必要とせずにゲルに直接ロードできます。これにより、サンプルが井戸に沈み、染料はDNAサンプルがどこまで移行したかを追跡するのに役立ちます。 横側のウェルに分子量標準を加える(好ましくは50bp分子量標準)。注: アガロースゲル電気泳動を繰り返す必要がある場合には、残りの PCR サンプルを -20 °C に保存してください。 1x TAEランニングバッファで約40分間、または約50bpで移動する黄色の色素前面がゲルの下端に達するまで、ゲルを150V(定数)で実行します。 青色光または紫外線(UV)光を適用しながらゲルを画像化し、フラグメント長分析のために画像を記録します。注意:UV光は目や皮膚に損傷を与える可能性があります。UVライトボックスを使用する場合は、常に防護服とUV安全メガネを着用してください。 機関の危険物ポリシーに従ってゲルを廃棄してください。 5. フラグメント長の結果の分析 注: 線形回帰分析を使用して、フラグメントの長さを推定します。 D1S80 PCRフラグメントのサイズを変更するには、50 bpの分子量標準レーン上のゲル写真に定規を置き、定規の上部がサンプルがロードされたウェルの底に並ぶ(図1)。注:分子量標準(50bp分子量標準)の線形回帰式を計算するために、スプレッドシートプログラムを使用しました。 表計算プログラムを用いて、50bpの分子量標準の各バンドのウェルからの距離(例えば、cm単位)を記録する(図2)。 50bp分子量標準の各フラグメントサイズのログ(例えば、ベース10)を決定し、そのログ値を表に入力する(図2)。 各データ点を、散乱図を用いて、縦軸(y軸)上のバンドサイズの対数の対数と、ゲルの上端から、水平軸(x軸)上の分子量標準の各バンドまでの測定実行距離をグラフにプロットする(図3)。 近似曲線(線形回帰線)を適合させ、回帰式(y = ax + b)とR2値をグラフに表示します(図4)。 各D1S80アンプリコンの移動距離(例えば、cm単位)を測定する(図5)。 回帰式を使用して各 D1S80 アンプリコンのサイズを推定する: y = ax + bここで y = フラグメントサイズのログa = ラインの傾き (ポイント 5 で計算)x = ウェルからの距離 (cm)b = 回帰直線が Y 軸を切り取る点(ポイント 5 で計算)注: y 値はフラグメントサイズのログを表すため、D1S80アンプリコンの bp 単位のフラグメントサイズを取得するには、アンチログ(10y)を計算する必要があります。 6. 試験された個人の対立元素における反復単位数の推定 注: D1S80 リピートユニットの長さは 16 bp です。 D1S80 の最小の既知のアレスは14の繰り返しを有する。ここで説明するアンプリコンスキームは、最終的なサイズに余分な145 bpを加算する隣接領域を持つアンプリコンを生成します。 表 1を使用して、各 PCR フラグメントに含まれる反復単位の数を推定します。線形回帰を使用して外挿されたサイズは、特定のアリールの8 bp以内にする必要があります。 各試験個体の遺伝子型を、アリール反復サイズ数の組み合わせとして記録する。