Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

Alejandro Lopez Gonzalez; L&#233;a Luciana; Cl&#233;mentine Le Nev&#233;; Julie Valantin; Laura Francols; Nicolas Gadot; Christophe Vanbelle; Laurianne Davignon; Laura Broutier

doi:10.3791/62280

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생물학

3차원 오가노이드 및 스페로이드 모델의 염색 및 고해상도 이미징

Published: March 27, 2021

doi:

10.3791/62280

Alejandro Lopez Gonzalez*¹, Léa Luciana*¹, Clémentine Le Nevé², Julie Valantin², Laura Francols², Nicolas Gadot², Christophe Vanbelle³, Laurianne Davignon⁴, Laura Broutier¹

¹Childhood Cancer & Cell Death (C3),Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), Lyon 69373, ²Plateforme Anatomopathologie Recherche,Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), ³Plateforme d’Imagerie cellulaire, Université de Lyon, Université Claude Bernard Lyon 1, INSERM 1052, CNRS 5286, Centre Léon Bérard, Centre de recherche en cancérologie de Lyon (CRCL), ⁴PerkinElmer S.A.S.

Summary

여기에서 자사는 100μm에서 수 밀리미터 범위의 고정 3차원 세포 배양 모델의 염색 및 세포내 분해능 이미징을 수행하기 위한 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜을 제공하여 형태, 세포 유형 구성 및 상호 작용을 시각화할 수 있습니다.

Abstract

오가노이드 및 스페로이드와 같은 체외 3차원(3D) 세포 배양 모델은 개발 및 질병 모델링, 약물 발견, 재생 의학을 포함한 많은 응용 분야에 유용한 도구입니다. 이러한 모델을 완전히 활용하려면 세포 및 세포 수준에서 연구하는 것이 중요합니다. 그러나 이러한 체외 3D 세포 배양 모델의 특성을 분석하는 것은 기술적으로 어려울 수 있으며 효과적인 분석을 수행하려면 특정 전문 지식이 필요합니다. 여기에서 이 백서는 100μm에서 수 밀리미터 범위의 고정된 체외 3D 세포 배양 모델의 염색 및 세포내 분해능 이미징을 수행하기 위한 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜을 제공합니다. 이러한 프로토콜은 기원 세포, 형태 및 배양 조건이 다른 다양한 유기체 및 스페로이드에 적용할 수 있습니다. 3D 구조 수집에서 이미지 분석에 이르기까지 이러한 프로토콜은 4-5일 이내에 완료할 수 있습니다. 간단히 말해서, 3D 구조를 수집 및 고정한 다음 파라핀 임베딩 및 조직학/면역조직화학 염색을 통해 처리하거나 직접 면역 표지를 하고 공초점 현미경으로 광학 투명화 및 3D 재구성(깊이 200μm)을 위해 준비할 수 있습니다.

Introduction

지난 수십 년 동안 줄기 세포 생물학 및 체외 3D 배양 기술의 발전은 생물학 및 의학 분야의 혁명을 예고했습니다. 3D의 복잡성이 높은 세포 모델은 세포가 성장하고 주변 세포 외 프레임워크와 상호 작용할 수 있도록 하여 구조, 세포 조직 및 상호 작용 또는 확산 특성을 포함하여 살아있는 조직의 측면을 밀접하게 요약하기 때문에 매우 인기가 있습니다. 따라서 3D 세포 배양 모델은 시험관 내에서 발달 중이거나 병든 조직에서 세포의 행동에 대한 고유한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 오가노이드와 스페로이드는 모두 수 마이크로미터에서 밀리미터에 이르는 다세포 3D 구조이며 가장 두드러진 체외 3D 구조입니다. 둘 다 (i) 동물(기저막 추출물, 콜라겐), 식물(알지네이트/아가로오스)에서 유래하거나 화학물질로부터 합성된 하이드로겔, 또는 (ii) 세포 증식 및 성장을 촉진하기 위해 공극을 포함하는 불활성 매트릭스를 포함하는 지지 스캐폴드 내에서 배양될 수 있다.

오가노이드와 스페로이드는 또한 지지 스캐폴드의 존재 없이 세포에 의존하여 클러스터로 자체 조립함으로써 개발할 수 있습니다. 이는 세포 부착, 표면 장력 및 중력(예: 행잉 드롭 기술) 또는 용기의 일정한 원형 회전(예: 스피너 배양)을 억제하기 위한 비접착성 재료의 사용과 같은 다양한 기술에 의존합니다. 모든 경우에 이러한 기술은 세포-세포 및 세포-매트릭스 상호 작용을 촉진하여 기존 단층^{세포 배양의} 한계를 극복합니다1. “오가노이드”와 “스페로이드”라는 용어는 과거에 같은 의미로 사용되었지만 이 두 3D 세포 배양 모델 간에는 중요한 차이점이 있습니다. 오가노이드는 만능 줄기 세포 또는 조직 특이적 줄기 세포에서 유래한 시험관 내 3D 세포 클러스터로, 세포가 자발적으로 전구체 및 분화된 세포 유형으로 자기 조직화^{되고 관심 기관의} 적어도 일부 기능을 요약합니다2. 스페로이드는 비부착 조건에서 형성된 광범위한 다세포 3D 구조로 구성되며 불멸화 세포주 또는 일차 세포와 같은 매우^{다양한 세포 유형}에서 발생할 수 있습니다3. 따라서 고유 줄기 세포 기원에 내재된 오가노이드는 스페로이드보다 자기 조립, 생존력 및 안정성에 대한 성향이 더 높습니다.

그럼에도 불구하고 본질적으로이 두 모델은 여러 세포로 구성된 3D 구조이며이를 연구하기 위해 개발 된 기술은 매우 유사합니다. 예를 들어, 단일 세포 분해능 수준의 강력한 이미징 접근 방식은 오가노이드와 스페로이드 모두의 세포 복잡성을 조사하는 데 필요합니다. 여기에서는 이 그룹의 전문성과 오가노이드⁴ 분야의 리더들의 전문성을 요약하여 100μm에서 수 밀리미터에 이르는 오가노이드 및 스페로이드의 세포 및 세포하 구성과 공간 조직에 대한 2차원(2D) 및 3D 전체마운트 염색, 이미징 및 분석을 수행하는 자세한 절차를 설명합니다. 실제로, 이 절차는 매우 다양한 크기와 유형의 시험관 내 3D 세포 배양 모델을 분석하기 위해 두 가지 서로 다른 보완적인 유형의 염색 및 이미징 획득을 제시합니다. 하나(3D 전체 마운트 해석) 또는 다른 하나(2D 단면 해석)의 사용은 연구된 모델과 찾는 답변에 따라 달라집니다. 예를 들어, 컨포칼 현미경을 통한 3D 전체 마운트 분석은 3D 구조의 전체 크기에 관계없이 최대 200μm 깊이의 3D 배양에서 세포를 시각화하는 데 적용할 수 있는 반면, 2D 단면 분석은 2D 수준이지만 모든 크기의 샘플에 대한 통찰력을 제공합니다. 이 절차는 다양한 배아 배아 층에서 유래 한 다양한 유기체 ^4,5 및 인간 및 쥐 세포에서 파생 된 스페로이드에 성공적으로 적용되었습니다. 절차의 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 주요 단계, 이들 간의 관계, 결정적인 단계 및 예상 타이밍이 표시됩니다.

그림 1: 절차의 개략도 개요. 체외 3D 세포 배양 모델을 수집하고 고정한 다음 3D 전체 마운트 염색(옵션 a)을 위해 준비하거나 2D 절단 및 염색(옵션 b)을 위해 파라핀에 포매합니다. 3D 전체 마운트 염색 실험의 경우, 고정 단계 후에 고정된 3D 구조가 면역표지됩니다. 선택적 광학 클리어링 단계를 수행하여 이미지 처리 중 광 산란을 줄임으로써 광학 현미경의 이미징 품질과 깊이를 개선할 수 있습니다. 이미지는 도립 컨포칼 현미경 또는 컨포칼 고함량 시스템에서 캡처되고 적절한 소프트웨어를 사용하여 분석됩니다. 파라핀 임베딩의 경우 3D 구조를 직접 처리하거나(400μm ≥ 대형 구조물의 경우 옵션 b.1) 탈수 및 파라핀 매립을 위해 겔(b.2, 400μm≤ 소형 구조)에 포함합니다. 그런 다음 파라핀 블록을 절단하고 염색합니다 (조직 학적 또는 면역 화학적 염색). 2D 단면의 이미지는 디지털 슬라이드 스캐너 또는 정립 현미경에서 획득하고 빠른 디지털 정량 분석을 사용하여 이미지 분석 플랫폼에서 분석합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Protocol

참고: 다음 절차에서 시약 변경 및 세척과 관련된 단계에서 초기 3D 구조 수의 ≤25%가 손실될 것으로 예상해야 합니다. 정성적 및 정량적 이미지 분석을 수행하기 위해 테스트된 조건당 크기가 100에서 500μm 사이인 최소 10개의 3D 구조의 최종 수를 사용하도록 계획합니다. 필요한 경우 더 큰 구조의 경우 구조가 파손되지 않도록 1mL 피펫 팁의 끝을 자릅니다. 모든 단계에서 3D 구조 침강이 너무 길면 실온(RT)에서 5분 동안 50× g 으로 셀을 부드럽게 회전시킬 수 있습니다. 조사된 문제에 따라 원심분리가 3D 구조의 모양을 손상시킬 수 있으므로 이러한 방사 단계의 장점/단점을 고려해야 합니다. >100 × g에서 회전하지 마십시오. 1. 3D 세포 배양 모델의 수집 및 고정 알림: 튜브 벽에 느슨하게 부착되는 3D 구조물을 흡입하지 않도록 주의하십시오. 매트릭스에 내장된 3D 세포 배양 모델 수집참고: 이 섹션에서는 쥐 Engelbreth-Holm-Swarm 육종(BME)에서 기저막 추출물 방울로 성장한 3D 구조의 회복에 대해 설명하지만 다른 매트릭스에 적용될 수 있습니다. ECM과 관련된 중요한 사항에 대해서는 토론을 참조하십시오.3D 매트릭스를 방해하지 않고 웰에서 배양 배지를 제거합니다. 팁의 전체 길이를 인산완충식염수(PBS)(이하 PBS-BSA 0.1% 용액이라고 함)의 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)에 담그고 이 용액 1mL를 위아래로 두 번 피펫팅하여 1mL 피펫 팁의 내부와 외부를 단백질(이하 사전 코팅된 1mL 팁이라고 함)로 프리코팅합니다.알림: 이 사전 코팅은 셀이 팁에 달라붙는 것을 방지하고 손실을 최소화합니다. PBS-BSA 0.1% 용액을 반복적으로 채우고 튜브를 비워 원심분리기(15mL) 튜브 내부를 단백질(이하 사전 코팅된 원심분리 튜브 라고 함)로 프리코팅합니다.알림: 이렇게 하면 셀이 튜브에 달라붙는 것을 방지하고 손실을 최소화할 수 있습니다. 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 얼음처럼 차가운 1x PBS 1mL를 사용하여 웰의 3D 구조를 조심스럽게 재현탁하고 3D 구조가 포함된 현탁액을 사전 코팅된 원심분리 튜브로 부드럽게 옮깁니다. 얼음처럼 차가운 1x PBS 13mL를 부드럽게 추가하고 3D 구조물이 최소 10분 동안 얼음 위에 침전되도록 합니다.참고: 필요한 경우 4°C에서 50× g 으로 5분 동안 회전합니다. 100 × g> 회전하면 3D 구조의 모양이 손상되므로 피하십시오. 상청액을 제거하십시오. 미리 코팅된 1mL 팁을 사용하여 얼음처럼 차가운 1x PBS 1mL에 3D 구조물을 부드럽게 재현탁합니다. 1.1.4 – 1.1.5단계를 반복하여 3D 매트릭스 잔류물이 없는 균질한 펠릿을 얻습니다.참고: 효율적인 매트릭스 제거는 매트릭스 유형, 3D 구조의 수 및 크기에 영향을 받으며 다양한 배양 조건에 맞게 최적화해야 합니다. BME에서 성장한 3D 구조의 경우 매트릭스 제거에서 복구하는 데 일반적으로 45-60분이 걸립니다. 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 3D 구조가 포함된 1mL 1x PBS 현탁액을 사전 코팅된 1.5mL 원심분리 튜브로 옮기고 섹션 1.3을 진행합니다. 부유식 3D 세포 배양 모델 수확사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 3D 구조를 조심스럽게 수집하여 사전 코팅된 1.5mL 원심분리 튜브로 옮깁니다. 3D 구조물이 침전되도록 하거나 RT에서 50× g 으로 5분 동안 회전합니다. 상청액을 제거하십시오. 미리 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1mL의 1x PBS에 3D 구조를 재현탁합니다. 섹션 1.3을 진행합니다. 3D 세포 배양 모델 고정3D 구조물이 침전되도록 합니다. 조심스럽게 상청액을 제거하십시오. 흄 후드 아래에서 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 포르말린 1mL에 3D 구조물을 부드럽게 재현탁합니다.알림: 포르말린에는 위험한 포름알데히드가 포함되어 있습니다. 화학 후드에서 화학 물질을 조작하십시오. 고무 장갑과 보안경을 착용하십시오. RT에서 30분 동안 3D 구조물을 배양합니다.참고: 포르말린을 사용한 30분 고정 단계는 광범위한 3D 구조(크기, 모양 및 기원이 다양함)의 면역 염색에 필요합니다. 그러나 일반적으로 더 긴 고정 시간(>3시간)이 리포터 단백질의 형광을 보존하는 데 더 적합합니다. 3D 구조물이 침전되도록 하거나 RT에서 50× g 으로 5분 동안 회전시킵니다. 포르말린을 부드럽게 제거하고 1mL의 1x PBS로 교체합니다. 1x PBS에서 이 세척 단계를 두 번 반복합니다. 샘플을 4°C에서 보관하고 섹션 2 또는 섹션 3으로 진행합니다.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 셀은 장기 보관(>1년)을 위해 4°C에서 유지할 수 있습니다. 2.3D 3D 세포 배양 모델의 전체 마운트 염색, 이미징 및 분석 알림: 오가노이드가 튜브 벽에 느슨하게 부착되어 있으므로 다음의 모든 시약 변경으로 인해 샘플이 손실될 수 있으므로 조심스럽게 다루십시오. 시작하기 전에 염색을위한 올바른 컨트롤의 가용성을 확인하십시오. 양성 및 음성 대조군은 관심있는 단백질이 각각 과발현되거나 부재하는 것으로 알려진 세포 일 수있다. 관찰된 신호가 2차 항체의 비특이적 결합에 의한 것인지 확인하기 위해 1차 항체 없이 샘플을 인큐베이션한다. 일부 세포는 높은 수준의 자가형광을 나타내는 경향이 있으므로 2차 항체가 없는 대조군을 사용하여 관찰된 형광이 배경 자가형광에서 나오는지 확인합니다. 면역표지와 형광 리포터 시각화를 결합할 수 있습니다. 3D 전체 마운트 염색1x PBS에 0.1%-1%의 비이온성 계면활성제( 재료 표 참조), 1% 디메틸설폭사이드, 1% BSA 및 1% 당나귀 혈청(또는 2차 항체가 제기된 동물로부터)을 보충하여 투과화 차단(PB) 용액을 준비합니다.참고: 표적의 국소화에 따라 비이온성 계면활성제의 농도를 조심스럽게 최적화하십시오: 막(0-0.5%), 세포질(0.5-1%) 및 핵(1%). 이 용액은 4°C에서 최대 1개월 동안 보관할 수 있습니다. BSA는 일반적으로 블로킹 단계에서 잘 작동하지만 배경 잡음이 높은 경우 주어진 항체 조합에 대해 가능한 최상의 결과를 얻기 위해 경험적 테스트를 수행하십시오. 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1.5mL 원심분리 튜브에서 0.5mL 튜브로 오가노이드를 옮깁니다. 오가노이드 침전물을 넣고 1x PBS를 부드럽게 제거한 다음 0.5mL의 PB 용액으로 교체합니다. RT에서 1 시간 동안 부드러운 수평 교반 (30-50 rpm)으로 유기체를 배양하십시오. 오가노이드 침전물을 넣고 PB 용액을 부드럽게 제거한 다음 1mL PBS-BSA 0.1%에서 3분 동안 두 번 세척합니다.알림: 3분 동안 기다리면 구조물이 튜브 바닥에 침전될 수 있습니다. PBS-BSA 0.1%를 부드럽게 제거하고 PB:1x PBS(1:10) 용액에 적절한 농도로 희석된 250μL의 1차 항체를 추가합니다. 10mL의 PB:1x PBS(1:10) 용액을 준비하려면 PB 용액 1mL를 1x PBS 9mL에 희석합니다. 4°C에서 부드러운 수평 교반(30-50rpm)으로 2-3일 동안 배양합니다.참고: 3D 구조가 때때로 큰 크기에 도달할 수 있으므로 적절한 항체 침투를 위해서는 적절한 항체 배양 시간이 중요합니다. 오가노이드가 침전되도록 하고, 1차 항체 용액을 부드럽게 제거한다. 세척 당 3 분 동안 PBS-BSA 0.1 %에서 5 회 세척 한 다음 부드러운 수평 교반으로 세척 당 15 분 동안 1L PBS-BSA 0.1 %에서 2 회 세척하십시오. PB:1x PBS(1:10) 용액에 1:250으로 희석된 2차 항체 250μL를 추가합니다. 부드러운 수평 교반 (30-50 rpm)으로 4 ° C에서 24 시간 동안 배양하십시오. 이 단계에서는 샘플을 빛으로부터 보호하십시오. PB:1x PBS(1:10) 용액에 1:1000으로 희석한 Hoechst 33342(20μM 원액) 250μL를 추가하고 부드러운 수평 교반(30-50rpm)으로 4°C에서 2시간 더 배양합니다. 오가노이드 침전물을 침전시키고, 2차 항체 + Hoechst 33342를 함유하는 용액을 부드럽게 제거한다. 오가노이드를 세척당 3분 동안 1mL의 1x PBS에 5x 세척한 다음 부드러운 수평 교반(30-50rpm)으로 세척당 15분 동안 1x PBS 1mL에 2x 세척합니다.알림: 배경 소음이나 신호 손실을 방지하기 위해 샘플을 광범위하게 세척하는 것이 중요합니다. 이미지 획득 때까지 샘플을 4°C에서 PBS에 보관한다. 섹션 2.2를 진행합니다.참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있으며 샘플은 빛으로부터 보호되어 몇 개월 동안 4°C에서 보관할 수 있습니다. 컨포칼 이미징을 위한 샘플 준비미리 코팅된 1mL 팁을 사용하여 오가노이드를 96웰 블랙 폴리스티렌 마이크로플레이트의 웰당 1x PBS 50μL에 조심스럽게 옮깁니다. 2.2.3단계 또는 섹션 2.3을 진행합니다.참고: 이 단계에서 샘플을 빛으로부터 보호하고 4°C에서 몇 주 동안 보관할 수 있습니다. 지우기참고: 투명화 단계는 선택 사항이며 오가노이드를 면역표지하거나 내인성 형광을 검출하는 데 사용할 수 있습니다. 클리어링은 3D 구조 수축을 유발할 수 있지만 큰 루멘을 가진 구형 단층 오가노이드를 제외하고는 일반적인 형태를 변경하지 않습니다4. 이러한 낭성 오가노이드의 경우 투명화 단계를 건너뛰고 심부 조직 이미징을 수행합니다6.용액이 완전히 용해되고 균질해질 때까지 적어도 밤새 자기 교반기에서 혼합하여 50% v/v 글리세롤, 11% v/v 증류수 및 45% w/v 과당을 포함하는 2.5M 글리세롤-과당 제거 용액을 준비합니다. 4 ° C에서 어두운 곳에서 최대 1 개월 동안 보관하십시오. 유기체를 만지지 않고 가능한 한 많은 1x PBS를 제거하십시오. 끝을 제거한 후 1mL 피펫 팁을 사용하여 투명액 200μL를 추가하고 거품이 형성되지 않도록 부드럽게 재현탁합니다. RT에서 최소 12시간 동안 배양하고 섹션 3을 진행합니다.알림: 클리어링 용액은 점성이 있기 때문에 소량의 처리가 어렵습니다. 취급을 용이하게하려면 용액이 RT에 있는지 확인하고 천천히 피펫팅하십시오. 최적의 투명화를 위해 이미징하기 전에 샘플이 투명화 용액에 최소 24시간 동안 침전되도록 하십시오. 획득 시 3D 구조물이 떠 있는 경우 RT에서 <100× g 으로 10분 동안 선택적 스핀을 수행하거나 침전물이 될 때까지 더 많은 시간(1일에서 며칠)을 허용합니다. 프로토콜이 빛으로부터 보호되고 4°C(몇 주) 또는 -20°C(수개월)에서 보관되는 경우 이미징을 진행하기 전에 이 단계에서 일시 중지할 수 있습니다. 이미지 수집 및 분석참고: 3D 구조를 이미지화하려면 이미지 절단 기술이 필요합니다.컨포칼 현미경을 사용하고 공기에 비해 개구수(NA)가 높은 침수 대물렌즈를 선호합니다. 3D 구조의 크기, 이미지 재구성(스티칭) 및 분석에 사용되는 솔루션에 따라 배율 대물렌즈(10x, 20x, 40x)를 선택합니다. 획득 모드를 선택할 때 Z 스태킹 단계를 정의하는 데 사용되는 대물렌즈의 초점 심도를 고려하십시오. 최적의 3D 렌더링을 허용합니다.참고: 이미지 분석 솔루션은 다양하며 사용된 소프트웨어에 맞게 분석을 조정해야 합니다. 예를 들어, 이 분석 프로토콜은 고함량 분석 소프트웨어( 자세한 내용은 재료 표 및 보충 그림 1 참조)에서 설정되었으며 3D 재구성 개체 내에서 개체 분할, 속성 계산 및 세포 집단 선택에 대한 데이터를 제공합니다. 3. 3D 세포 배양 모델의 2D 절단, 염색, 이미징 및 분석 참고: 3D 세포 배양 모델의 크기는 다양합니다. 효율적인 파라핀 임베딩을 위해 섹션 3.1 또는 3.2를 진행합니다(그림 2). 세척 및 시약 변경 전에 3D 구조 침강을 위한 충분한 시간을 허용하십시오. 튜브 바닥에 떠 있는 유기체를 흡입하지 않도록 주의하십시오. 파라핀 임베딩에 대해서는 그림 2 를 참조하십시오. 대형(Ø ≥ 400μm) 3D 세포 배양 모델의 파라핀 임베딩매립 전날, 파라핀(파라핀 배스)으로 채워진 2개의 150mL 플라스크, 샘플당 작은 금속 매립 몰드, 미세 집게를 65°C로 예열합니다. 사전 코팅된 1mL 팁을 사용하여 1x PBS의 오가노이드를 폴리테트라플루오로에틸렌 안감 병 뚜껑이 있는 평평한 바닥 유리관에 조심스럽게 옮깁니다. 오가노이드 침전물을 제거하고 1x PBS를 조심스럽게 제거한 다음 70% 에탄올로 교체합니다. 최소 30분 동안 배양합니다. 오가노이드 침전물을 침전시키고, 70% 에탄올을 조심스럽게 제거한다. 즉시 사용 가능한 에오신 Y 용액 1mL로 교체하십시오. 튜브를 튕기고 최소 30분 동안 염색합니다. 에오신 용액을 조심스럽게 제거하고 오가노이드를 1mL의 100% 에탄올로 각각 ~30분 동안 세 번 연속 세척하여 탈수합니다.알림: 가연성 및 휘발성 액체 인 에탄올은 심한 눈과 호흡기 자극을 유발합니다. 흄 후드에서 조작하고 보호용 눈 고글을 착용하십시오. 100% 에탄올을 조심스럽게 제거하고 화학 후드 아래에서 각각 ~30분 동안 1mL의 크실렌으로 3회 연속 세척하여 오가노이드를 제거합니다.알림: 크실렌은 증기가 자극을 유발할 수 있는 독성이 있는 액체 가연성 물질입니다. 흄 후드에서 조작하십시오. 피부에 직접 닿지 않도록 하고 고무 장갑과 보호용 눈 고글을 착용하십시오. 화학 후드 아래에서 카세트의 구획 중 하나에 생검 패드 (이전에 크실렌에 담근 것)를 배치하여 흰색 마이크로 트윈 조직 카세트를 준비합니다. 사전 코팅된 2mL 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 3D 구조물을 생검 패드로 조심스럽게 옮깁니다. 오가노이드가 움직이지 않도록 크실렌에 적신 다른 생검 패드로 덮고 카세트를 닫습니다. 여러 샘플이 처리되는 경우 카세트를 크실렌 욕조에 넣어 추가 처리를 기다립니다. 모든 샘플이 카세트로 옮겨지면 카세트를 예열된 파라핀 수조에 65°C에서 30분 동안 넣습니다. 카세트를 신선한 예열 파라핀 욕조에 밤새 옮깁니다. 파라핀 함침 후, 예열 된 임베딩 몰드를 취하고, 가열 된 파라핀을 첨가한다. 3D 구조가 포함된 생검 패드를 금형에 넣고 모든 유기체가 금형 바닥에 떨어질 때까지 부드럽게 저어줍니다. 예열 된 미세 집게를 사용하여 3D 구조를 금형 중앙에 매우 조심스럽게 배치합니다. 섹션 3.3을 진행합니다.알림: 집게로 3D 구조를 방해하지 않도록주의하십시오. 밀지 만 꼬집지 마십시오. 소형(Ø ≤ 400 μm) 3D 세포 배양 모델의 파라핀 임베딩매립 전날, 파라핀(파라핀 배스)으로 채워진 2개의 150mL 플라스크, 샘플당 작은 금속 매립 몰드, 미세 집게를 65°C로 예열합니다. 오가노이드 현탁액에서 1x PBS를 조심스럽게 제거합니다. 1x 트리스 완충 식염수(TBS) 1mL에 3회 부드럽게 세척합니다. 오가노이드를 만지지 않고 가능한 한 많은 1x TBS를 제거하십시오.참고: 샘플을 흡입하지 않도록 주의하십시오. 필요한 경우 RT에서 50 x g에서 5 분 스핀을 수행하십시오. 남아있는 인산염은 다음 단계를 방해하여 특히 겔 중합을 방지합니다. 따라서 처리 단계에서 PBS 솔루션을 사용하지 마십시오. 이 단계에서는 카세트, 시약 #1(투명 유체) 및 시약 #2(유색 유체)가 포함된 상용 키트를 사용하여 잠재적으로 작은 조각을 잃지 않고 파라핀 포매 절차를 용이하게 했습니다( 재료 표 참조). 키트 지침을 따릅니다. 카세트는 이미 제자리에 있는 백킹 용지와 보드 인서트로 사전 조립되어 있습니다. 시약 #2 2방울을 튜브에 넣고 튜브를 두드려 부드럽게 섞습니다. 시약 #1 2방울을 넣고 두드려 다시 섞어 젤이 굳어지도록 합니다. 가는 집게를 사용하여 튜브에서 젤을 제거하고 카세트의 우물에 놓습니다. 흄 후드 아래에서 다음과 같이 카세트를 연속 수조에 넣어 샘플을 탈수시킵니다(150mL 플라스크를 사용하고 각 수조에 신선한 에탄올 또는 크실렌 사용): 에탄올 70%, 30분; 에탄올 96 %, 30 분; 에탄올 100 %, 3 회 세척, 각각 30 분; 크실렌, 3회 세척, 각 30분. 카세트를 65°C에서 30분 동안 예열된 파라핀 배스에 넣고 밤새 신선한 예열된 파라핀 배스로 옮깁니다. 파라핀 함침 후, 예열 된 임베딩 몰드를 취하고, 가열 된 파라핀을 첨가한다. 카세트를 열고 미세한 집게로 젤을 조심스럽게 빼낸 다음 3D 구조가 포함된 젤을 매립 몰드의 중앙에 놓습니다. 섹션 3.3을 진행합니다. 파라핀 임베딩의 일반적인 단계금형을 차가운 지역으로 부드럽게 옮겨 파라핀이 얇은 층으로 응고되도록 하여 3D 구조를 적절한 위치에 유지합니다. 금형 위에 티슈 카세트를 추가하고 뜨거운 파라핀을 추가하여이 플라스틱 카세트를 덮습니다. 금형이 완전히 고형화되면 제거하고 섹션 3.4를 진행합니다.알림: 파라핀 블록은 실온에서 수년간 보관할 수 있습니다. 그림 2: 크고 작은 체외 3D 세포 배양 모델의 파라핀 임베딩 절차 개요.(A) 파라핀 포매를위한 표준 절차. 고정 및 탈수 후 3D 구조는 시각화를 용이하게하기 위해 에오신으로 염색됩니다 (왼쪽 상단 및 하단). 3D 구조는 2mL 파스퇴르 피펫(가운데)을 사용하여 카세트의 생검 패드(파란색)에 조심스럽게 배치됩니다. 파라핀 함침 후, 3D 구조는 집게를 사용하여 액체 파라핀에 부드럽게 떨어 뜨리고 생검 패드에서 부드럽게 교반합니다. 작은 3D 구조는 패드에서 해제할 수 없으므로 이 단계에서 손실됩니다(오른쪽 하단: 임베딩 실패). 대형 3D 구조만 포함됩니다(오른쪽 상단: 성공적인 임베딩). 화살촉은 3D 문화권을 가리킵니다. (B) 표준 파라핀 임베딩 프로토콜에 대한 대안. 작은 3D 구조를 고정한 후 상용 키트를 사용하여 세포를 젤에 유지하고 파라핀 함침 후 금형으로 쉽게 옮길 수 있습니다(오른쪽: 성공적인 임베딩). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 블록 절단 및 염색표준 마이크로톰을 사용하여 4μm 절편을 절단하고 표준 조직학적 및 면역조직화학적 기술을 수행한다. 섹션 3.5를 진행합니다.참고: 특정 슬라이드( 재료 표 참조)는 섹션의 더 나은 접착을 위해 사용되었습니다. 슬라이드는 실온 또는 4 ° C에서 수년간 보관할 수 있습니다. 이미지 수집 및 분석디지털 슬라이드 스캐너 또는 정립 현미경을 사용하여 이미징을 수행하고, 전체 3D 구조 섹션에 걸쳐 세포별로 형태학적 및 다중화된 발현 데이터를 보고하는 빠른 디지털 정량 분석을 위한 플랫폼을 사용하여 데이터를 분석합니다(자세한 내용은 보충 그림 2 참조).참고: 20x 목표는 이 그룹에서 일상적으로 사용됩니다.

Representative Results

이 프로토콜은 2D 및 3D 전체 마운트 염색뿐만 아니라 3D 세포 배양 모델의 이미징 및 정량 분석에 대한 중요한 단계에 대한 개요를 제공합니다 (그림 3 및 그림 4). 스페로이드에서 다양한 숙주 종 또는 조직의 오가노이드에 이르기까지 광범위한 3D 세포 배양 모델에 적용할 수 있으며 세포 및 아세포 수준에서의 구조, 세포 조직 및 상호 작용에 대한 정확하고 정량적인 정보를 획득할 수 있습니다 (그림 3 및 그림 4). 실험실은 필요에 따라 2D 조직학적 및 면역조직화학적 기술과 항체 농도를 최적화해야 할 수 있습니다. 두 방법 모두 귀중한 생물학적 정보를 제공합니다. 3D 전체 장착 염색 및 컨포칼 현미경은 최대 200μm의 깊이로 세포 구성 및 공간 위치에 대한 시각적 정보를 제공합니다(그림 3B). 그러나 2D 절단은 더 큰 샘플에서 분해능을 손상시키는 광산란으로 인해 현장에서 관찰하기 어려울 수 있는 3D 구조의 전체 섹션에서 상세한 세포 형태학적 특성을 드러내는 데 더 큰 3D 구조에 편리합니다. 또한 두 기술 모두 정량적 데이터를 제공 할 수 있습니다. 실제로, 얻어진 분해능은 세포 수의 정량화 및 상이한 세포 아형에서 다양한 세포 마커의 존재의 검출을위한 세포 및 세포 내 분할 알고리즘의 적용을 허용한다 (그림 3F 및 그림 4). 요약하면, 여기에 설명된 이미징 기술은 재현 가능하고 간단하며 보완적이며 세포 이질성을 연구하는 데 유용한 도구를 나타냅니다. 그림 3: 3D 및 2D 광학 섹션의 3D 전체 장착, 이미징 및 분석에 대한 대표적인 결과. (A) 일주일 동안 배양하고 Hoechst(파란색), Olig2(노란색) 및 액틴(빨간색)으로 라벨링한 인간 (h) 고급 신경교종 스페로이드의 컨포칼 이미지(20x 물 대물렌즈). 획득한 모든 이미지에 대해 양성 대조군(상단)을 사용하여 현미경 설정을 설정한 다음 동일한 설정을 사용하여 음성 대조군을 이미징하여 1차 항체가 없는 상태에서 형광 부족을 제어했습니다(하단). (B) 일주일 동안 배양된 (h) 고급 신경교종 스페로이드에서 수행된 Ki67 염색의 직교 3D 전체 장착 표현(글리세롤-과당 투명화; 20x 물 대물렌즈, 공초점). (C) 일주일 동안 배양하고 Hoechst(파란색), Olig2(노란색) 및 팔로이딘-488(녹색)로 표지한 (h) 고급 신경교종 스페로이드의 컨포칼 이미지(글리세롤-과당 투명화, 20x 물 대물렌즈). (D) 일주일 동안 배양하고 각각 Hoechst(파란색), Actin(빨간색) 및 Ki67(녹색)로 표지한 인간(h) 횡문근육종(상단) 및 마우스(m) 신경 볏 세포(하단) 스페로이드의 컨포칼 이미지(글리세롤-과당 제거, 20x 건조 대물렌즈). (E) 일주일 동안 배양하고 Hoechst(파란색) 및 Ki67(녹색)로 표지한 (h) 고급 신경교종 스페로이드의 컨포칼 이미지(글리세롤-과당 투명화, 40x 물 대물렌즈)(왼쪽 상단). Hoechst 채널의 분할 이미지와 녹색 채널의 Ki67 양성(+) 핵 영역은 고함량 분석 소프트웨어를 사용하여 생성되었습니다( 보충 그림 1 및 재료 표 참조)(하단). 주어진 출력은 분할된 67D 구조당 Ki3+ 핵의 백분율입니다(오른쪽 상단). 스케일 바 = 100 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 그림 4: 2D 광학 단면의 이미징 및 분석에 대한 대표적인 결과. (A, D) 디지털 슬라이드 스캐너로 얻은 3D 세포 모델(한 달 동안 배양한 인간 횡문근육종 스페로이드)의 2D 단면 이미지로, 빠른 디지털 정량 분석을 위한 플랫폼에서 분석했습니다. (A) H&E 염색 및 크기에 따른 세포 검출. 스케일 바 = 500 μm. (B) 히스토그램은 빠른 디지털 정량 분석(왼쪽: Halo) 또는 수동 계수(오른쪽: MC)를 위한 소프트웨어를 사용하여 검출된 100 μm2 및 > 100 μm2 < 세포의 백분율을 보여줍니다. (C) Ki67 염색 및 이들의 3,3′-디아미노벤지딘(DAB) 신호의 강도에 따른 세포의 검출. 음수 (파란색), 약한 양성 (노란색), 양성 (빨간색). 스케일 바 = 500 μm. (D) 히스토그램은 Ki67 음성, 약한 양성 및 양성 세포의 백분율을 보여줍니다. 약어 : H & E = 헤 마톡 실린 및 에오신; MC = 수동 계산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 보충 그림 1: 이미징 분석 소프트웨어의 단계 개요. 분석은 빌딩 블록의 연관성을 기반으로 합니다. 각 빌딩 블록은 기능 분할, 계산, 연관, 출력 정의에 해당하며 이미징되는 생물학적 샘플과 일치하도록 여러 알고리즘 및 변수 선택을 제공합니다. 이 소프트웨어는 쉽게 사용하고 수정할 수 있는 여러 RMS(Ready Made Solution) 분석 프로토콜을 제공합니다. 통합 이미지 분석 프로토콜을 저장하고, 다양한 데이터 세트에 적용하고, 사용자 간에 공유할 수 있습니다. 간단히 말해서, 분석 프로토콜은 순차적 인 객체 분할을 의미합니다 : 스페로이드, 핵 및 마지막으로 Ki67 포켓 (A488). 그런 다음 Ki67 포켓의 평균 강도를 계산하여 긍정적 인 이벤트를 추가로 구별합니다. 마지막으로, Ki67 포지티브 포켓을 포함하는 핵이 긍정적으로 선택됩니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오. 보충 그림 2: 정량 분석 소프트웨어의 절차 단계 개요. 1 단계. 스터디 탭을 사용하여 파일을 업로드합니다. 파일이 이미지 작업 섹션에서 열립니다. 2 단계. 주석 탭을 연 다음 레이어 액션을 클릭하여 도구 모음의 원 도구를 사용하여 구조 주위에 새 레이어를 디자인합니다. 원형이 아닌 구조의 경우 펜 도구를 대신 사용할 수 있습니다. 3 단계. 도구 모음을 사용하여 주석을 디자인하고 도구로 정량화를 시각화할 수 있습니다 . 4 단계. 분석 탭을 열고 샘플 분석 에 가장 적합한 조건을 선택합니다(여기에서 여러 번의 시도가 필요할 수 있음). 4.1 단계. 얼룩 선택 섹션을 사용하여 얼룩 상태를 설정합니다. 여러 얼룩이 있는 경우 이를 추가하고 이름을 바꿀 수 있으며 가상 색상을 수정할 수 있습니다. 국소화 검출은 핵 또는 세포질 염색으로 지정할 수 있습니다. 4.2 단계. 셀 감지 섹션을 사용하여 셀 감지 를 설정합니다. 이 섹션은 분석에 가장 중요합니다. 핵 대비 임계 값 섹션은 모든 핵의 검출을 가능하게합니다. 여러 모집단 크기가있는 경우주의를 기울여야하며 소프트웨어는 고유 한 큰 세포 대신 여러 세포를 감지 할 수 있습니다. 핵 크기 및 핵 분할 공격성 섹션을 사용하여 세포 크기 집단 범위를 정량화할 수 있습니다. 5 단계. 샘플 분석을 실행하는 방법에 대한 설명입니다. 그림에 표시된 단계를 따릅니다. 주석 레이어 섹션은 이 슬라이드에서만 설정을 실행합니다. 정량화는 도구를 사용하여 시각화할 수 있습니다 . 적절한 정량화가 달성될 때까지 4.1-5단계를 반복합니다. 단계 6-6.1. 이 단계를 통해 소프트웨어를 사용하여 그림을 그릴 수 있습니다. 7 단계. 소프트웨어를 통해 얻은 정량화 그래픽을 저장할 수 있습니다. 8 단계. 데이터를 내보낼 수 있습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

세포 배양은 조직 및 장기 발달, 기능, 재생 및 파괴, 질병과 관련된 기본적인 생물학적 메커니즘을 밝히는 데 없어서는 안될 도구입니다. 단층 2D 세포 배양이 우세했지만, 최근 연구는 특히 유전자 발현 및 세포 행동에 영향을 미치는 추가적인 공간 조직 및 세포-세포 접촉으로 인해 생체 내 세포 반응을 더 잘 반영하는 3D 구조를 생성하는 배양으로 전환되어 더 많은^{예측 데이터를 제공할} 수 있습니다7. 그럼에도 불구하고 세포 및 세포 수준에서 복잡한 3D 구조의 상세한 현미경 시각화 및 평가를 위한 사용자 친화적인 염색 및 이미징 기술의 필요성을 포함하여 많은 과제가 남아 있습니다. 이러한 맥락에서 100μm에서 수 밀리미터 크기의 고정 시험관 내 3D 세포 배양 모델의 염색 및 세포 및 세포 내 분해능 이미징을 수행하기 위해 상세하고 강력하며 보완적인 프로토콜이 제공되었습니다.

이 절차는 다양한 크기와 유형의 체외 3D 세포 배양 모델을 처리하기 위한 두 가지 전략을 제시합니다. 하나(3D 전체 마운트 해석) 또는 다른 하나(2D 단면 해석) 중 하나는 사용된 모델과 조사된 문제에 따라 달라집니다. 컨포칼 현미경을 통한 3D 전체 마운트 분석을 통해 3D 구조의 전체 크기에 관계없이 최대 200μm의 깊이장을 가진 세포를 시각화할 수 있는 반면, 2D 절단은 모든 크기의 샘플에 적용할 수 있지만 시각화는 2D 차원으로 유지됩니다. 다음은 문제 해결 및 기술 고려 사항에 대한 몇 가지 제안 사항입니다.

작업 흐름 중 3D 구조의 손실은 가장 일반적인 단점입니다. 팁과 튜브에 접착력을 유지할 수 있기 때문에 팁과 튜브를 PBS-BSA 0.1% 용액으로 사전 코팅하는 것이 중요합니다. 또한 시약 변경 사이에 3D 구조물이 침전되도록 하고 모든 피펫팅을 매우 신중하게 수행하는 것이 중요합니다. 절차에서 언급했듯이 모든 단계에서 3D 구조 침강이 너무 길면 RT에서 5분 동안 50× g 으로 세포를 부드럽게 회전시킬 수 있습니다. 연구의 목적에 따라 원심분리가 3D 구조의 모양을 손상시킬 수 있으므로 이러한 방사 단계의 장점/단점을 고려해야 합니다. 또한, 낭포 성 유기체는 붕괴되는 경향이 있기 때문에 고정 단계에서 이러한 형태를 보존하는 데주의를 기울여야합니다. 크기가 400μm 미만인 구조물을 고정하면 구조적 변화를 방지해야 합니다.

최적의 면역표지를 위해서는 3D 매트릭스에서 오가노이드를 회수하는 것이 중요한 단계입니다. 3D 매트릭스는 매트릭스에 대한 비특이적 결합으로 인해 적절한 항체 침투를 방해하거나 높은 배경 염색을 유발할 수 있습니다. ECM 제거는 오가노이드의 외부 세그먼트의 형태를 변경하고 (특히 연구 된 3D 구조에서 확장되는 작은 세포 돌출부의 경우) 분석을 부분적으로 방해 할 수 있습니다. 이러한 3D 구조의 경우 매트릭스는 절차 전반에 걸쳐 유지 될 수 있습니다. 그러나, 배양 조건은 용액 및 항체의 불충분한 침투를 방지하고 과도한^{배경 소음을} 감소시키기 위한 연속적인 세척 단계를 피하기 위해 최소량의 매트릭스에서 세포를 성장시키도록 신중하게 조정되어야 한다^6,8.

3D 전체 마운트 염색 섹션의 이 프로토콜에 설명된 광학 투명화 단계는 투명하지 않은 50-80μm 대신 최대 150-200μm 깊이의 3D 구조 이미징에 적합합니다. 종종 몇 주가 필요하고 독성 제거제를 사용하는 다른 청산 방법론과 비교하여 이전에 발표된 빠르고 안전한 청산 단계가 이 프로토콜 ^4,9에서 사용되었습니다. 또한, 이러한 투명화 단계는 가역적이며, 새로운 항체는 해상도^{또는 밝기의} 손실 없이 초기 염색에 첨가될 수 있다4. 그럼에도 불구하고, 연구된 3D 세포 배양 모델에 따라, 150-200 μm의 깊이는 유익한 방식으로 3D 구조를 이미지화하기에 충분하지 않을 수 있으며, 이 투명화 프로토콜은 큰 루멘을 갖는 구형, 단층 오가노이드의 일반적인 형태에 변화를 일으킬 수^있다4. 사용자는 실험을 신중하게 설계하고 필요한 경우 투과화/차단 단계(항체 및 용액의 침투를 허용하기 위해), 투명화 단계(200μm보다 더 깊이 침투하려면 표본을 완전히 제거해야 함) 및 이미지 획득의 타이밍을 최적화해야 합니다. 핵심 시설에서 사용할 수 있는 가장 널리 사용되는 두 가지 기술은 라이트 시트와 컨포칼 현미경입니다. 사용자는 3D 구조의 크기와 생물학적 질문¹⁰에 따라 기술을 신중하게 선택해야합니다. 그러나, 공초점 현미경과 비교하여, 이러한 심층 구조에 대해 얻어진 광학 시트 현미경 해상도는 세포 내 해상도를 얻기 위해 차선책으로 남아 있습니다.

여기에서는 단일 샘플의 파라핀 임베딩에 전념하는 상세하고 강력한 프로세스가보고되었습니다. 흥미롭게도 Gabriel 등은 최근 증가된 처리량으로 파라핀에 3D 세포 배양을 내장하는 프로토콜을 개발했습니다. 그들은 폴리디메틸실록산(PDMS) 주형을 사용하여 96개의 3D 구조를 하나의 블록에 마이크로어레이 패턴으로 가두어 더 많은 그룹, 시점, 치료 조건 및 복제물¹¹을 포괄하는 3D 종양 모델에 대한 연구에 새로운 관점을 제공했습니다. 그러나 이 방법은 특히 PDMS 금형을 만드는 데 사용되는 프리몰드의 제작을 위해 광범위한 기술과 기계가 필요합니다.

요약하면, 이 백서에서는 3D 셀룰러 모델의 아키텍처 및 셀룰러 구성에 대한 정확하고 정량적인 정보를 획득할 수 있는 두 가지 서로 다른 보완적이고 적응 가능한 접근 방식을 설명합니다. 두 매개 변수 모두 종양 내 세포 이질성 및 치료에 대한 내성에서의 역할과 같은 생물학적 과정을 연구하는 데 중요합니다.

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작업은 St Baldrick의 Robert J. Arceci Innovation Award #604303의 지원을 받았습니다.

Materials

Equipment
Biopsy pad Q Path blue	VWR	720-2254
Cassettes macrostar III Blc couv. Char. x1500	VWR	720-2233
Cassette microtwin white	VWR	720-2183
Chemical hood	Erlab	FI82 5585-06
Filter tips 1000 µL	Star lab Tip-One	S1122-1730
Fine forceps	Pyramid innovation	R35002-E
Flat-bottom glass tubes with PTFE lined 2 mL	Fisher Scientific	11784259	Excellent for environmental samples, pharmaceuticals and diagnostic reagents. PTFE is designed for the ultimate in product safety. PTFE provides totally inert inner seal and surface facing the sample or product.
Glass bottom dish plate 35 mm	Ibedi	2018003
Horizontal agitation	N-BIOTEK	NB-205
Incubator prewarmed to 65 °C	Memmert Incubator	LAB129
Inox molds 15×15	VWR	720-1918
Microscope Slides Matsunami TOMO-11/90	Roche diagnostics	8082286001	these slides are used for a better adhesion of sections
Microtome	Microm Microtech France	HM340E
Panoramic scan II	3dhistech	2397612
Paraffin embedding equipment	Leica	EG1150C
Plastic pipette Pasteur 2 mL	VWR	612-1681
Q Path flacon 150mL cape blanc x250	VWR	216-1308	Good for environmental samples, pharmaceuticals and diagnostic reagents. Polypropylene (PP) are rigid, solid, provide excellent stress crack and impact resistance and have a good oil and alcohol barrier and chemical resistance. PE-lined cap is stress crack resistant and offers excellent sealing characteristics.
Set of micropipettors (p200, p1000)	Thermo Scientific	11877351 (20-200) 11887351(p1000)
OPERA PHENIX	PerkinElmer	HH14000000
SP5 inverted confocal microscope	Leica	LSM780
Tissue cassette	VWR	720-0228
Zeiss Axiomager microscope	Leica	SIP 60549
Reagent
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7030-100G
Cytoblock (kit)	Thermofisher Scientific	10066588
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	57648266	CAUTION: toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Eosin aqueous 1%	Sigma-Aldrich	HT110316
Ethanol 96%	VWR	83804.360	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Ethanol 100%	VWR	20821.365	CAUTION: Causes severe eye irritation. Flammable liquid and vapor. Causes respiratory tract irritation. Manipulate in a fume hood. Wear protective eye goggles.
Formalin 4%	Microm Microtech France	F/40877-36	CAUTION: Formalin contains formaldehyde which is hazardous. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Fructose	Sigma-Aldrich	F0127
Gill hematoxylin type II	Microm Microtech France	F/CP813
Glycerol	Sigma-Aldrich	G5516	500 mL
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570	CAUTION: Suspected of causing genetic defects. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves and protective eye goggles.
Normal donkey serum	Sigma-Aldrich	D9663	10 mL
Paraffin Wax tek III	Sakura	4511
Phosphate Buffer Saline (PBS) 1 X	Gibco	14190-094
Tris-Buffered Saline (TBS) 10X	Microm Microtech France	F/00801	100 mL
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532	CAUTION: Triton X100 is hazardous. Avoid contact with skin and eyes.
Xylene	Sigma-Aldrich	534056	CAUTION: Xylene is toxic and flammable. Vapors may cause irritation. Manipulate in a fume hood. Avoid direct contact with skin. Wear rubber gloves, protective eye goggles.
Solutions
Clearing solution			Glycerol-Fructose clearing solution is 60% (vol/w) glycerol and 2.5 M fructose. To prepare 10 mL of this solution, mix 6 mL of glycerol and 4.5 g of fructose. Complete to 10 mL with dH2O. Use a magnetic stirrer overnight. Refractive index = 1.4688 at room temperature (RT: 19–23 °C). Store at 4 °C in dark for up to 1 month.
PBS-BSA 0,1% solution			To prepare 0,1% (vol/wt) PBS-BSA 0,1% solution, dissolve 500 mg of BSA in 50 mL of PBS-1X (store at 4°C for up to 2 weeks). And dilute 1mL of this solution into 9mL of PBS-1X. This solution can be used to precoat the tip and centrifugation tube.
Permeabilisation-blocking solution (PB solution)			The PBSDT blocking solution is PBS-1X supplemented with 0.1% – 1% Tritonx-100 (depending on the protein localization membrane/nucleus), 1% DMSO, 1% BSA and 1% donkey serum (or from the animal in which the secondary antibodies were raised). This solution can be stored at 4°C for up to 1 month.
PB:PBS-1X (1:10) solution			PB:PBS-1X (1:10) solution is a 10 time diluted PB solution. To prepare 10 mL of this solution dilute 1 mL of PB solution in 9 mL of PBS-1X.
Software
Halo software	Indicalabs	NM 87114
Harmony software	PerkinElmer	HH17000010

References

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Gonzalez, A. L., Luciana, L., Le Nevé, C., Valantin, J., Francols, L., Gadot, N., Vanbelle, C., Davignon, L., Broutier, L. Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models. J. Vis. Exp. (169), e62280, doi:10.3791/62280 (2021).