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신경과학

Un Ensayo Basado En Espectroscopia De Fluorescencia Eficiente En El Tiempo Para Evaluar El Estado De Polimerización De Actina En Roedores Y Tejidos Cerebrales Humanos

Published: June 03, 2021
doi:
10.3791/62268
,
1Department of Anatomy, School of Biomedical Sciences,University of Otago

Summary

Divulgamos un ensayo simple, eficiente en el tiempo y de alto rendimiento basado en espectroscopia de fluorescencia para la cuantificación de filamentos de actina en muestras biológicas ex vivo de tejidos cerebrales de roedores y sujetos humanos.

Abstract

La actina, el componente principal del citoesqueleto, desempeña un papel crítico en el mantenimiento de la estructura y la función neuronales. Bajo estados fisiológicos, la actina se produce en equilibrio en sus dos formas: globular monomérica (G-actina) y filamentosa polimerizada (F-actina). En los terminales sinápticos, el citoesqueleto de actina forma la base para las funciones críticas pre y post-sinápticas. Además, los cambios dinámicos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre las formas globulares y filamentosas de actina) están estrechamente relacionados con las alteraciones relacionadas con la plasticidad en la estructura y función sináptica. Se presenta aquí una metodología basada en fluorescencia modificada para evaluar el estado de polimerización de la actina en condiciones ex vivo. El ensayo emplea faloidina marcada fluorescentemente, una fallotoxina que se une específicamente a los filamentos de actina (F-actina), proporcionando una medida directa de actina filamentosa polimerizada. Como prueba de principio, proporcionamos pruebas de la idoneidad del ensayo tanto en roedores como en homogeneados de tejido cerebral humano post mortem. Usando la latrunculina A (una droga que despolimeriza los filamentos de la actina), confirmamos la utilidad del análisis en alteraciones de la supervisión en niveles de la F-actina. Además, extendemos el ensayo a fracciones bioquímicas de terminales sinápticos aislados en los que confirmamos un aumento de la polimerización de actina tras la estimulación por despolarización con altoK+extracelular.

Introduction

La actina de la proteína citoesquelérea está implicada en funciones celulares múltiples, incluyendo la ayuda estructural, el transporte celular, la movilidad y la división celulares. La actina se produce en equilibrio en dos formas: actina globular monomérica (G-actina) y actina filamentosa polimerizada (F-actina). Los cambios rápidos en el estado de polimerización de la actina (interconversión entre sus formas G y F) dan lugar a un rápido montaje y desmontaje de filamentos y subyacen a sus funciones reguladoras en la fisiología celular. La actina forma el componente principal de la estructura citoesquelética neuronal e influye en una amplia gama de funciones neuronales1,2. Cabe destacar que el citoesqueleto de actina forma parte integral de la plataforma estructural de los terminales sinápticos. Como tal, es un determinante importante de la morfogénesis sináptica y la fisiología y juega un papel fundamental en el control del tamaño, número y morfología de las sinapsis3,4,5. En particular, la polimerización-despolimerización dinámica de actina es un determinante clave de la remodelación sináptica asociada con la plasticidad sináptica subyacente a los procesos de memoria y aprendizaje. De hecho, tanto las funciones presinápticas (como la liberación de neurotransmisores6,7,8,9,10)como las funciones postsinápticas (remodelación dinámica relacionada con la plasticidad11,12,13,14)dependen críticamente de los cambios dinámicos en el estado de polimerización del citoesqueleto de actina.

En condiciones fisiológicas, los niveles de F-actina se regulan de forma dinámica y rigurosa a través de una vía multimodal que implica la modificación postraduccional4,15,16, así como proteínas de unión a actina (ABP)4,17. Los ABP pueden influir en la dinámica de la actina a múltiples niveles (como iniciar o inhibir la polimerización, inducir la ramificación de filamentos, cortar los filamentos a piezas más pequeñas, promover la despolimerización y proteger contra la despolimerización), y a su vez están bajo un estricto control modulador sensible a diversas señales extra e intracelulares18,19,20. Tales controles regulatorios en múltiples niveles dictan una regulación estricta de la dinámica de la actina en el citoesqueleto sináptico, afinando los aspectos pre y postsinápticos de la fisiología neuronal tanto en los estados basales como inducidos por la actividad.

Dados los importantes papeles de la actina en la fisiología neuronal, no es sorprendente que varios estudios hayan proporcionado evidencia de alteraciones en la dinámica de la actina como eventos patógenos críticos relacionados con una amplia gama de trastornos neurológicos, incluyendo neurodegeneración, enfermedades psicológicas, así como dolencias del neurodesarrollo3,21,22,23, 24,25,26,27. A pesar de la riqueza de datos de investigación que apuntan a los papeles clave de la actina en la fisiología neuronal y la fisiopatología, sin embargo, todavía quedan lagunas significativas en la comprensión de la dinámica de la actina, particularmente en el citoesqueleto sináptico. Se necesitan más estudios de investigación para tener una mejor comprensión de la actina neuronal y sus alteraciones en condiciones patológicas. Una de las principales áreas de interés en este contexto es la evaluación del estado de polimerización de la actina. Hay kits comerciales a base de western blotting (kit bioquímico de ensayo G-Actin/F-Actin in vivo; Citoesqueleto SKU BK03728,29)y ensayos caseros para la evaluación de los niveles de F-actina6. Sin embargo, debido a que estos requieren el aislamiento bioquímico de la F-actina y la G-actina y porque su cuantificación posterior se basa en protocolos de immunoblotting, pueden ser lentos. En este documento se presenta un ensayo basado en espectroscopia de fluorescencia adaptado de un estudio previo30 con modificaciones que pueden ser utilizados para evaluar tanto los niveles basales de F-actina, así como los cambios dinámicos en su montaje-desmontaje. En particular, hemos modificado eficientemente el protocolo original que requiere muestras adecuadas para una cubeta de 1 mL al formato actual de placa de 96 pozos. Por lo tanto, el protocolo modificado ha reducido significativamente la cantidad de tejido/muestra necesaria para el ensayo. Además, proporcionamos evidencia de que el protocolo es adecuado no solo para homogeneados de tejido cerebral, sino también para fracciones subcelulares como terminales sinápticos aislados (sinaptosomas y sinaptoneurosomas). Por último, el ensayo se puede emplear para tejidos cerebrales de roedores recién disecados y muestras de cerebro humano post mortem almacenadas a largo plazo. Cabe destacar que, si bien el ensayo se presenta en un contexto neuronal, puede extenderse adecuadamente a otros tipos de células y procesos fisiológicos asociados con ellos.

Protocol

Todos los procedimientos experimentales se llevaron a cabo de conformidad con las normas del Comité de Ética en el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio de la Universidad de Otago (Protocolo de Ética No. AUP95/18 y AUP80/17) y legislatura de Nueva Zelanda. Los tejidos cerebrales humanos se obtuvieron del Banco de Tejidos Neurológicos del Biobanco del Hospital Clínic-IDIBAPS de Barcelona, España. Todos los protocolos de recolección de tejidos fueron aprobados por el Comité de Ética del Hospital Clínic de Barc…

Representative Results

Linealidad del ensayo para la evaluación de los niveles de F-actinaEn primer lugar, se comprobó una curva estándar para el aumento lineal de la fluorescencia de Alexa Fluor 647 Phalloidin, que se repitió para cada conjunto de experimentos (Figura 1). Para investigar el rango lineal del ensayo, se procesaron diferentes cantidades de homogenados cerebrales de roedores(Figuras 2A y 2B)y sujetos humanos post mortem(F…

Discussion

El ensayo aquí descrito, esencialmente adaptado de un estudio anterior30 con modificaciones, emplea una fallotoxina, faloidina etiquetada con una etiqueta fluorescente. Los análogos fluorescentes de faloidina se consideran el estándar de oro para la tinción de filamentos de actina en tejidos fijos47,48,49. De hecho, son las herramientas más antiguas para identificar específicamente los filamentos de…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por la Fundación Neurológica de Nueva Zelanda (1835-PG), el Consejo de Investigación de Salud de Nueva Zelanda (#16-597) y el Departamento de Anatomía de la Universidad de Otago, Nueva Zelanda. Estamos en deuda con el Banco de Tejidos Neurológicos del Biobanco HCB-IDIBAPS (España) para tejidos cerebrales humanos. Agradecemos a Jiaxian Zhang por su ayuda en la grabación y edición del video.

Materials

3.5 mL, open-top thickwall polycarbonate tube Beckman Coulter 349622 For gradient centrifugation (synaptosome prep)
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 F-actin specific ligand
Antibody against  b-actin Santa Cruz Biotechnology Sc-47778 For evaluation of total actin levels by immunoblotting
Antibody against GAPDH Abcam Ab181602 For evaluation of GAPDH levels by immunoblotting
Bio-Rad Protein Assay Dye Reagent Concentrate Bio-Rad 5000006 Bradford based protein estimation
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) Sigma-Aldrich C3306 Krebs buffer component
cOmplete, Mini, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Sigma-Aldrich 4693159001 For inhibition of endogenous protease activity during sample preparation
Corning 96-well Clear Flat Bottom Polystyrene Corning 3596 For light-scattering measurements
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 Krebs buffer component
Dimethyl sulfoxide Sigma-Aldrich D5879 Solvent for phalloidin and latrunculin A
Fluorescent flatbed scanner (Odyssey Infrared Scanner) Li-Cor Biosciences For detection of immunoreactive signals on immunoblots
Glutaraldehyde solution (25% in water) Grade II Sigma-Aldrich G6257 Fixative
HEPES Sigma-Aldrich H3375 Buffer ingredient for sample preparation and Krebs buffer component
Latrunculin A Sigma-Aldrich L5163 Depolymerizer of actin filaments
Magnesium chloride hexahydrate (MgCl2·6H2O) Sigma-Aldrich M2670 Krebs buffer component
Microplates
Mitex membrane filter 5 mm Millipore LSWP01300 Preparation of synaptoneurosomes
Nunc F96 MicroWell Black Plate Thermo Fisher Scientific 237105 For fluorometric measurements
Nylon net filter 100 mm Millipore NY1H02500 Preparation of synaptoneurosomes
Phosphatase Inhibitor Cocktail IV Abcam ab201115 For inhibition of endogenous phosphatase activity during sample preparation
Potassium chloride (KCl) Sigma-Aldrich P9541 Krebs buffer component and for depolarization of synaptic terminals
Potassium phosphate monobasic ((KH2PO4) Sigma-Aldrich P9791 Krebs buffer component
Sodium borohydride (NaBH4) Sigma-Aldrich 71320 Component of Permeabilization buffer
Sodium chloride (NaCl) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL944 Krebs buffer component
Sodium hydrogen carbonate (NaHCO3) LabServ (Thermo Fisher Scientific) BSPSL900 Krebs buffer component
SpectraMax i3x Molecular Devices For fluorometric measurements
Sucrose Fisher Chemical S/8600/60 Buffer ingredient for sample preparation
Swimnex Filter Holder Millipore Sx0001300 Preparation of synaptoneurosomes
Tissue grinder 5 mL Potter-Elvehjem Duran Wheaton Kimble 358034 For tissue homogenization
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100 Component of Permeabilization buffer
Trizma base Sigma-Aldrich T6066 Buffer ingredient for sample preparation
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Ahmad, F., Liu, P. A Time-Efficient Fluorescence Spectroscopy-Based Assay for Evaluating Actin Polymerization Status in Rodent and Human Brain Tissues. J. Vis. Exp. (172), e62268, doi:10.3791/62268 (2021).
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