Un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza efficiente in termini di tempo per valutare lo stato di polimerizzazione dell'actina nei tessuti cerebrali dei roditori e umani

L’actina della proteina citoscheletricha è coinvolta in molteplici funzioni cellulari, tra cui supporto strutturale, trasporto cellulare, motilità cellulare e divisione. L’actina si trova in equilibrio in due forme: actina globulare monomerica (G-actina) e actina filamentosa polimerizzata (F-actina). I rapidi cambiamenti nello stato di polimerizzazione dell’actina (interconversione tra le sue forme G e F) si traducono in un rapido assemblaggio e smontaggio dei filamenti e sono alla base dei suoi ruoli regolatori nella fisiologia cellulare. Actina forma il componente principale della struttura citoscheletricha neuronale e influenza una vasta gamma di funzioni neuronali^1,2. Da notare che l’actina citoscheletro forma parte integrante della piattaforma strutturale dei terminali sinaptici. Come tale, è un importante determinante della morfogenesi sinaptica e della fisiologia e svolge un ruolo fondamentale nel controllo delle dimensioni, del numero e della morfologia delle sinapsi^3,4,5. In particolare, l’actin polimerizzazione dinamica-depolimerizzazione è un fattore determinante del rimodellamento sinaptico associato alla plasticità sinaptica alla base dei processi di memoria e apprendimento. Infatti, sia le funzioni presnaptiche (come il rilascio di neurotrasmettitori^6,7,8,9,10) che le funzioni postsinaptiche (rimodellamento dinamico correlato alla plasticità^11,12,13,14)si basano criticamente su cambiamenti dinamici nello stato di polimerizzazione dell’actina citoscheletro.

In condizioni fisiologiche, i livelli di F-actina sono regolati dinamicamente e strettamente attraverso una via multimodale che comporta la modifica posttraslazionale^4,15,16 e proteine leganti l’actina (ARP)^4,17. Gli ARP possono influenzare la dinamica dell’actina a più livelli (come l’avvio o l’inibizione della polimerizzazione, l’induzione della ramificazione dei filamenti, la recidenza dei filamenti a pezzi più piccoli, la promozione della depolimerizzazione e la protezione dalla depolimerizzazione) e sono a loro volta sotto un rigoroso controllo modulatorio sensibile a vari segnali extra- e intracellulari^18,19,20. Tali controlli normativi a più livelli impongono una rigida regolazione della dinamica dell’actina nel citoscheletro sinaptico, per mettere a punto gli aspetti pre e postinaptici della fisiologia neuronale sia allo stato basale che indotto dall’attività.

Dati gli importanti ruoli dell’actina nella fisiologia neuronale, non sorprende che diversi studi abbiano fornito prove di alterazioni della dinamica dell’actina come eventi patogeni critici legati a una vasta gamma di disturbi neurologici tra cui neurodegenerazione, malattie psicologiche e disturbi del neurosviluppo^{3,21,22,23,24,25,26,27}. Nonostante la ricchezza di dati di ricerca che indicano ruoli chiave dell’actina nella fisiologia neuronale e nella fisiopatologia, tuttavia, permangono lacune significative nella comprensione delle dinamiche dell’actina, in particolare nel citoscheletro sinaptico. Sono necessari ulteriori studi di ricerca per avere una migliore comprensione dell’actina neuronale e delle sue alterazioni in condizioni patologiche. Una delle principali aree di interesse in questo contesto è la valutazione dello stato di polimerizzazione dell’actina. Esistono kit commerciali occidentali a base di gonfiore (kit biochimico di dosaggio G-Actin/F-Actin in vivo; Cytoskeleton SKU BK037^28,29) e saggi fatti in casa per la valutazione dei livelli di F-actin⁶. Tuttavia, poiché questi richiedono l’isolamento biochimico di F-actina e G-actina e poiché la loro successiva quantificazione si basa su protocolli di immunoblotting, possono richiedere molto tempo. Nel presente documento viene descritto un saggio a base di spettroscopia a fluorescenza adattato da uno^{studio precedente 30} con modifiche che possono essere utilizzate per valutare sia i livelli basali di F-actina, sia i cambiamenti dinamici nel suo assemblaggio-smontaggio. In particolare, abbiamo modificato in modo efficiente il protocollo originale che richiede campioni adatti per una cuvetta da 1 mL all’attuale formato di piastra da 96 porti. Il protocollo modificato ha quindi ridotto significativamente la quantità di tessuto/campione richiesta per il saggio. Inoltre, forniamo prove che il protocollo è adatto non solo per gli omogeneati del tessuto cerebrale, ma anche per le frazioni subcellulari come terminali sinaptici isolati (sinaptosomi e sinaptoneurosomi). Infine, il saggio può essere utilizzato per tessuti cerebrali roditori appena sezionati e campioni cerebrali umani post mortem conservati a lungo termine. Da notare che, mentre il saggio è presentato in un contesto neuronale, può essere opportunamente esteso ad altri tipi di cellule e processi fisiologici ad essi associati.