הפעלה תלת-ממדית של המוח כולו ומיפוי קישוריות תפקודית בעכברים באמצעות הדמיית אולטרסאונד תפקודית טרנס-ת-רה-אופן
Summary
פרוטוקול זה מתאר את הכימות של וריאציות המודינמיות המוח נפחיות במוח העכבר באמצעות אולטרסאונד פונקציונלי (fUS). נהלים עבור מפת הפעלה פונקציונלית תלת-ממדית בעקבות גירוי חושי כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה מסופקים כדוגמאות להמחשה, בעכברים מרדים וערים.
Abstract
הדמיית אולטרסאונד פונקציונלית (fUS) היא אודל הדמיה מוחית חדשנית הנשענת על מדד הרגישות הגבוהה של נפח הדם המוחי שהושג על ידי אנגיוגרפיה דופלרית אולטרה מהירה. כמו זלוף המוח קשורה קשר הדוק לפעילות עצבית מקומית, טכניקה זו מאפשרת מיפוי תלת-ממדי של המוח כולו של הפעלה אזורית הנגרמת על ידי משימות, כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה, באופן לא פולשני, עם רזולוציה מרחבית-זמנית ללא תחרות ופשטות תפעולית. בהשוואה ל- fMRI (הדמיית תהודה מגנטית תפקודית), יתרון עיקרי של הדמיית fUS מורכב מהפעלת תאימות מלאה לניסויים בבעלי חיים ערים ומתנהגים. יתר על כן, מיפוי המוח fMRI בעכברים, המודל הקדם-אקליני הנפוץ ביותר במדעי המוח, נותר מאתגר מבחינה טכנית בשל גודלו הקטן של המוח וקושי לשמור על מצבים פיזיולוגיים יציבים. כאן אנו מציגים פרוטוקול פשוט, אמין וחזק להדמיית fUS של המוח כולו בעכברים מרדים וערים באמצעות מערכת fUS מסחרית מדף עם מתמר ליניארי ממונע, המניב הפעלה קליפת המוח משמעותית בעקבות גירוי חושי, כמו גם דפוס קישוריות פונקציונלי 3D לשחזור לזיהוי רשת.
Introduction
בשני העשורים האחרונים, דימות מוחי הפך לכלי חשוב לחקר תפקוד המוח וארגון, המאפשר לחוקרים לגלות תגליות חשובות בתחום מדעי המוח. כיום, הדמיית תהודה מגנטית תפקודית (fMRI) הפכה לטכניקת הדמיית המוח הקלינית הסטנדרטית לזהב להערכת משימה או הפעלת מוח מעוררת סמים ומיפוי קישוריות תפקודית במנוחה. בעוד fMRI אנושי יש אמינות גבוהה ורגישות, fMRI עכבר נשאר מאתגר מבחינה טכנית מסיבות רבות1. ראשית, fMRI יש רזולוציה מרחבית וטמפורלית ירודה. הגודל הקטן של מוח העכבר מחייב שימוש בשדות מגנטיים חזקים באמצעות סורקים יקרים כדי להשיג רזולוציה מרחבית סבירה. שנית, שמירה על פרמטרים פיזיולוגיים יציבים בטווח הצר המאפשר צימוד נוירו-וסקולרי יעיל קשה מאוד בעכברים מרדים. לבסוף, רמת החמצן בדם תלויה (BOLD) אות שעליו מחקרי fMRI מסתמכים יש רגישות ירודה יחסית, המוביל יחס אות לרעש נמוך כאשר מוחל על עכברים ולעתים קרובות דורש הצגת גירוי חוזר על פני רכישה ארוכה כדי לזהות וריאציות קטנות. העכבר הוא המודל החייתי הנפוץ ביותר במחקר פרה-רפואי ביו-רפואי, מגבלות אלה אחראיות בחלקן לפער התרגומי בנוירופסיכיאטריה, ומעכבות מטרות טיפוליות מבטיחות חדשות על הספסל שיוחזו לטיפולים יעילים על המיטה.
אולטרסאונד פונקציונלי (fUS) היא טכניקת הדמיה מוחית שפותחה לאחרונה המבוססת על דופלר אולטרה מהיר2. על ידי דגימה ישירה של נפח הדם במוח, טכניקה זו מאפשרת לחטט בפעילות המוח בזמן אמת באמצעות צימוד נוירווסקולרי. בהשוואה לטכניקות דימות מוחי אחרות, fUS מניב רזולוציה מרחבית של 100 מיקרומטר ורזולוציה זמנית בעשרות אלפיות השנייה. טכניקה זו מאפשרת הדמיה מוחית שלמה של חלקים קורונל שלם של מוח העכבר, לגמרי לא פולשני. יתר על כן, הוא תואם לחלוטין עם בעלי חיים מודעים ומתנהגים3,4,5. אחת המגבלות הנוכחיות העיקריות של fUS היא התכונה הדו-פעמית שלה, המאפשרת להקליט מטוס קורונל יחיד בו זמנית. בעוד נפח 3D fUS באמצעות מתמרים מערך מטריצה 2D כבר הוכח בהצלחה בחולדות6 ואושר בעכברים7, חוסר הרגישות הנוכחי שלה דורש גולגולת מלאה, כמו גם ממוצע מספר חשוב של ניסויים כדי לזהות שינוי קל של פעילות. לחלופין, ניתן לדרוך על מתמרים ליניאריים על פני עמדות מרובות ולבצע הדמיה תפקודית מישור אחר מטוס כדי לכסות את כל המוח. עם זאת, טכניקה זו דורשת חזרות פרדיגמה ניסיוניות רבות וכזמן רכישה ארוך כזה (3-4 שעות למוח העכבר)8,9.
בעבודה הנוכחית, אנו מתארים פלטפורמה ניסיונית חזקה הכוללת סורק אולטרסאונד פונקציונלי זמין מסחרית ומתמר ליניארי מהיר מיתוג מטוס עם נהלים לרכישת נתוני fUS 3D בעכברים מורדמים וערים, המאפשר מיפוי פונקציונלי נפחי ותפקודי transcranial של מוח העכבר, לא פולשני, ללא סוכן ניגודיות ובזמני רכישה קצרים. אנו ממחישים תכונה זו על ידי מיפוי הפעלת קליפת המוח הסומטו-סנסורית בעקבות גירוי שפם, כמו גם קישוריות תפקודית של מצב מנוחה. מלבד הכנה לבעלי חיים ואיסוף נתונים, אנו מתארים גם את ההליך להדמיה, רישום אטלס וניתוח של אותות fUS בזמן אמת.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטות הדמיה מוחיות שלמות הן כלים חיוניים להבנת פיזיולוגיה ופתולוגיה של המוח טוב יותר. השיטה המתוארת כאן מאפשרת כימות מדויק של אותות המונמיים במוח החי ישירות על הספסל. הרגישות ללא תחרות ורזולוציה spatio-temporal של אולטרסאונד פונקציונלי מתאים במיוחד עבור פיזיולוגיה העכבר. ניתן למפות תגובות פונקציונליות ורשתות מצב מנוחה בתוך זמני רכישה קצרים, לאורך וללא צורך בממוצע ניסויים או נושאים כדי להשיג מידה אמינה. השילוב הרלוונטי של בדיקות ליניאריות קוליות רגישות גבוהה והגדרות ממונעות מהירות מאפשר לבצע הדמיה fUS נפחית transcranial בעכברים בתוך זמני רכישה סבירים. פרוטוקול זה יכול להתבצע על עכברים מרדים או ערים באמצעות כלוב ביתי נייד.
גירוי שפם, הגירוי החושי המשמש כדוגמה להמחשה בכתב יד זה, הוא פרדיגמת הפעלה פונקציונלית סטנדרטית במכרסמים וקריאה אמינה לחקר עיבוד חושי, צימוד נוירווסקולרי ושינויים5,6,10,11. בעוד צחצוח ידני גס של השפם עשוי להיות מועדף על קלות השימוש שלה, שיטה זו חסרה דיוק מרחבי וטמפורלי. השימוש ממריץ אוטומטי, כגון זה המתואר כאן מופעל עם סורק הדמיה fUS, מאפשר שליטה טובה יותר של מספר פרמטרים כולל זמן תחילת, עקירת משרעת, התדירות, כמו גם את הזווית של Q-tip / מסרק, וכתוצאה מכך רבייה בין בעלי חיים טובה יותר. בנוסף, תזמון מדויק יותר של גירוי מאפשר מידול של פונקציית התגובה המודינמית (HRF) על ידי קביעת הזמן להתפרצות וזמן לשיאפרמטרים 12,13. כדי להבטיח דיוק טוב יותר במספר השפם שהוסטה במהלך הגירוי (וכך את אזור האזור המופעל), ניתן להתאים ממריצים מתוחכמים יותר לפרוטוקול זה. גירויים רבים אחרים כגון אור8, צליל14 או מצגת ריח15 ניתן ליישם באמצעות אותו פרוטוקול.
התאימות של אולטרסאונד פונקציונלי עם בעלי חיים ערים ומתנהגים היא יתרון חשוב בהשוואה לטכניקות דימות מוחי אחרות, המאפשרות מיפוי הפעלה פונקציונלי ללא הטיית ההרדמה. שימוש במכלאה ניידת מורמת אוויר היא חלופה טובה למנגנונים קיימים אחרים עם תיקון ראש, כגון הליכונים ליניאריים או כדוריים. תוך תיקון ראש בחוזקה, התנועה של הבית נותן לעכבר את האשליה לנווט בסביבה, ומאפשר מגוון רחב של בדיקות התנהגותיות להיות מצמידים הדמיה fUS16. עם זאת, הליך ההרגלה לתיקון ראש מהווה צעד חשוב להפחתת הלחץ, במיוחד עבור ניסויים שבהם זה יכול להיחשב גורם מבלבל. ההליך המפורט כאן (6 ימים של טיפול והרגל לקיבוע ראש) נותן תוצאות חזקות לגירוי חושי וקישוריות תפקודית של מצב מנוחה. עם זאת, ייתכן שיהיה צורך להאריך את תקופת ההרגלה לבדיקות התנהגותיות מעודנות יותר17.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מועצת המחקר האירופית (ERC) מענק מתקדם N° 339244-FUSIMAGINE, הסוכנות הלאומית למימון מחקר ‘קמצוץ’ (ANR-18-CE37-005), מאיץ טכנולוגיות המחקר של Inserm באולטרסאונד ביו-רפואי, הליבה הטכנית של ElfUS של ה- IPNP, Inserm U1266, תוכנית המחקר האירופית FUSIMICE של פרויקט המוח האנושי, ומלגת EMBO לטווח קצר 8439 לאנדריאה קליוור.
Materials
| BD Plastipak 1 mL syringes | Dutscher, France | 303172 | |
| BD Microlance 26 Gauge needles | Dutscher, France | 303800 | |
| Animal Temperature Controller (heating Plate coupled with a rectal probe) | Physitemp | TCAT-2DF | |
| Arduino | Arduino | Arduino Uno-Rev3 | |
| Atipamezole | Orion Pharma, France | Antisedan® | 5 mg/ml injectable solution |
| Dental Ciment | Sun Médical, Shiga, japan | Superbond C&B | |
| Depilatory cream | Klorane | N/A | |
| Eye Ointment | TVM, UK | Ocry-gel | |
| Hair trimmer | Wella Profesionnals | N/A | |
| Head plates | Neurotar, Finland | Model 14 | |
| Iconeus One standard package for fUS | Iconeus, France | Iconeus One | |
| IcoScan acquisition software (v1.0) | Iconeus, France | IcoScan | |
| IcoStudio analysis software (v1.0) | Iconeus, France | IcoStudio | |
| Isoflurane Anesthesia station | Minerve, Esternay, France | ||
| Ketamine | Virbac, France | Ketamine1000 | 100 mg/ml injectable solution |
| Lidocaine | Vetoquinol | Lurocaine® | 20 mg/ml injectable solution |
| Medetomidine | Orion Pharma, France | Domitor® | 1 mg/ml injectable solution |
| Meloxicam | Boehringer lingelheim | Metacam® | 0.5 mg/ml injectable solution |
| Mobile HomeCage Large with tracking capability | Neurotar, Finland | MHC-L-T-V4 | |
| Monitoring of ECG and breathing rate | AD Systems, (USA) and LabChart software | ||
| Servomotor | Feetech | FT90B | |
| Stereotaxic frame | David Kopf (Tujunga, USA) | 900-WA | Using Mouse Adaptor (Ref: 922) and Non-Rupture Ear Bars (ref: 922) |
| Surgical glue | 3M, USA | Vetbond | |
| Syringe Pump | KD Scientific, USA | Legato® 130, Cat# 788130 | |
| Ultrasound gel | DREXCO medical, France | Medi'Gel | |
| Xylazine 2% | Bayer, France | Rompun® | 20 mg/ml injectable solution |
References
- Hoyer, C., Gass, N., Weber-Fahr, W., Sartorius, A. Advantages and challenges of small animal magnetic resonance imaging as a translational tool. Neuropsychobiology. 69 (4), 187-201 (2014).
- Deffieux, T., Demene, C., Pernot, M., Tanter, M. Functional ultrasound neuroimaging: a review of the preclinical and clinical state of the art. Current Opinion in Neurobiology. 50, 128-135 (2018).
- Rabut, C., et al. Pharmaco-fUS: Quantification of pharmacologically-induced dynamic changes in brain perfusion and connectivity by functional ultrasound imaging in awake mice. NeuroImage. 222, 117231 (2020).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Ferrier, J., Tiran, E., Deffieux, T., Tanter, M., Lenkei, Z. Functional imaging evidence for task-induced deactivation and disconnection of a major default mode network hub in the mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 117 (26), 15270-15280 (2020).
- Rabut, C., et al. 4D functional ultrasound imaging of whole-brain activity in rodents. Nature Methods. 16 (10), 994-997 (2019).
- Brunner, C., et al. A platform for brain-wide volumetric functional ultrasound imaging and of circuit dynamics in awake mice. Neuron. 108 (5), 861-875 (2020).
- Gesnik, M., et al. 3D functional ultrasound imaging of the cerebral visual system in rodents. NeuroImage. 149, 267-274 (2017).
- Macé, &. #. 2. 0. 1. ;., et al. Whole-brain functional ultrasound imaging reveals brain modules for visuomotor integration. Neuron. 100 (5), 1241-1251 (2018).
- Macé, E., Montaldo, G., Cohen, I., Baulac, M., Fink, M., Tanter, M. Functional ultrasound imaging of the brain. Nature Methods. 8 (8), 662-664 (2011).
- Tiran, E., et al. Transcranial functional ultrasound imaging in freely moving awake mice and anesthetized young rats without contrast agent. Ultrasound in Medicine and Biology. 43 (8), 1679-1689 (2017).
- Claron, J., et al. Large scale functional ultrasound imaging of the spinal cord reveals in depth spatiotemporal responses of spinal nociceptive circuits in both normal and inflammatory state. Pain. , (2020).
- Aydin, A. K., et al. Transfer functions linking neural calcium to single voxel functional ultrasound signal. Nature Communications. 11 (1), 2954 (2020).
- Bimbard, C., et al. Multi-scale mapping along the auditory hierarchy using high-resolution functional ultrasound in the awake ferret. eLife. 7, 35028 (2018).
- Boido, D., et al. Mesoscopic and microscopic imaging of sensory responses in the same animal. Nature Communications. 10 (1), 1110 (2019).
- Kislin, M., et al. Flat-floored air-lifted platform: A new method for combining behavior with microscopy or electrophysiology on awake freely moving rodents. Journal of Visualized Experiments. (88), e51869 (2014).
- Juczewski, K., Koussa, J. A., Kesner, A. J., Lee, J. O., Lovinger, D. M. Stress and behavioral correlates in the head-fixed method: stress measurements, habituation dynamics, locomotion, and motor-skill learning in mice. Scientific Reports. 10 (1), 12245 (2020).
