Doble etiquetado inmunofluorescencia utilizando anticuerpos de la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno
Summary
Aquí, el protocolo describe cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie para estudiar las interacciones huésped-patógeno. Además, puede incluir el tercer anticuerpo de un huésped diferente en este protocolo. Este enfoque se puede hacer en cualquier tipo de célula y patógenos.
Abstract
Hoy en día, es posible encontrar una amplia gama de herramientas moleculares disponibles para estudiar las interacciones parásito-célula huésped. Sin embargo, existen algunas limitaciones para obtener anticuerpos monoclonales o policlonales comerciales que reconozcan estructuras celulares y proteínas específicas en los parásitos. Además, hay pocos anticuerpos comerciales disponibles para etiquetar tripanosomátidos. Por lo general, los anticuerpos policlonales contra los parásitos se preparan internamente y podrían ser más difíciles de usar en combinación con otros anticuerpos producidos en la misma especie. Aquí, el protocolo demuestra cómo usar anticuerpos policlonales y monoclonales criados en la misma especie para realizar inmunofluorescencia de doble etiquetado para estudiar las interacciones entre la célula huésped y el patógeno. Para lograr la inmunofluorescencia de doble etiquetado, es crucial incubar primero el anticuerpo policlonal de ratón y luego seguir la incubación con el anticuerpo IgG secundario de ratón conjugado a cualquier fluorocromo. Después de eso, es necesario un paso de bloqueo adicional para evitar que cualquier rastro del anticuerpo primario sea reconocido por el siguiente anticuerpo secundario. Luego, un anticuerpo monoclonal de ratón y su anticuerpo secundario de subclase IgG específico conjugado a un fluorocromo diferente se agregan a la muestra en los momentos apropiados. Además, es posible realizar un triple etiquetado de inmunofluorescencia utilizando un tercer anticuerpo criado en una especie diferente. Además, estructuras como los núcleos y la actina se pueden teñir posteriormente con sus compuestos o etiquetas específicas. Por lo tanto, estos enfoques presentados aquí se pueden ajustar para cualquier célula cuyas fuentes de anticuerpos primarios son limitadas.
Introduction
Estudiar la interacción del patógeno con la célula huésped a nivel celular proporciona información esencial sobre las causas subyacentes de la enfermedad, ya que diferentes grupos, como virus, bacterias y protozoos, pueden infectar a la mayoría de los tipos de células huésped1,2,3,4. También puede ayudar a desarrollar e identificar posibles objetivos terapéuticos que pueden retardar o inhibir el crecimiento del patógeno. En condiciones de vida, los anticuerpos producidos son responsables de reconocer autocomponentes, antígenos de virus, componentes o productos bacterianos, hongos, parásitos y otros5.
Para este propósito, los anticuerpos son herramientas ampliamente utilizadas, principalmente para comprender la ubicación y la función de las estructuras celulares y las proteínas. Varios estudios que utilizan el etiquetado de múltiples anticuerpos demuestran que los pasos de bloqueo adicionales contribuyen a la especificidad de la inmunolocalización. Además, la mayoría de los protocolos descritos utilizan anticuerpos monoclonales comerciales específicos, incluidos anticuerpos de la misma especie huésped6,7,8,9,10,11,12,13,14.
Por lo general, la inmunofluorescencia de doble etiquetado utiliza dos anticuerpos criados en diferentes especies para teñir las estructuras celulares de interés o los patógenos y las células huésped para ver la interacción entre ellos. Sin embargo, esto puede ser un problema cuando no hay anticuerpos monoclonales o policlonales comerciales específicos para algunos patógenos disponibles para realizar el doble etiquetado. Además, existen kits de conjugación de anticuerpos disponibles comercialmente, y es posible conjugar los anticuerpos primarios directamente al fluoróforo mediante una reacción de éster de succinimidil15. El problema es que estos kits suelen ser caros, y es necesario tener suficientes anticuerpos para etiquetarlos. Sabiendo esto, desarrollamos con éxito un método de doble inmunofluorescencia utilizando dos anticuerpos diferentes criados en la misma especie para estudiar la localización de proteínas en Trypanosoma brucei16. Sin embargo, para los parásitos intracelulares, incluido Trypanosoma cruzi, este enfoque no se ha demostrado. Aquí, mostramos cómo realizar la inmunofluorescencia de doble etiquetado para estudiar los parásitos intracelulares de T. cruzi y la célula huésped utilizando anticuerpos primarios criados en la misma especie sin reacciones cruzadas. Además de este método, se ha establecido un etiquetado de triple inmunofluorescencia con la adición del tercer anticuerpo de una especie diferente. Estos enfoques ayudan cuando la fuente de anticuerpos es limitada y se puede utilizar en cualquier tipo de célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí, presentamos un protocolo para realizar un doble inmunoetiquetado en células infectadas por Trypanosoma cruzi utilizando dos anticuerpos diferentes de la misma especie huésped. Para estudiar, con más detalle, las implicaciones de la infección, se pueden etiquetar estructuras en la célula huésped como el núcleo u orgánulos citosólicos utilizando este protocolo. Además, se puede utilizar en el método de etiquetado de inmunogold de sección delgada posterior a la incrustación. Este enfoque ayuda a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) a MMAB, por fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA a MMAB y por Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior- Brasil (CAPES) – código financiero 001. CG-C recibió una beca de maestría y doctorado de CAPES y LAMT-S recibió una beca de doctorado de CNPq. Agradecemos a Elizabete R. Milani por la asistencia en microscopía confocal y al Dr. Darío Zamboni por proporcionar células LLC-MK2 (Facultad de Medicina de Ribeirao Preto, USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
References
- Lloyd, R. E. Nuclear proteins hijacked by mammalian cytoplasmic plus strand RNA viruses. Virology. 479-480, 457-474 (2015).
- Casadevall, A., Pirofski, L. A. Host-pathogen interactions: basic concepts of microbial commensalism, colonization, infection, and disease. Infection and Immunity. 68 (12), 6511-6518 (2000).
- Sidik, S. M., Salsman, J., Dellaire, G., Rohde, J. R. Shigella infection interferes with SUMOylation and increases PML-NB number. PLoS One. 10 (4), 0122585 (2015).
- Robert McMaster, W., Morrison, C. J., Kobor, M. S. Epigenetics: A New Model for Intracellular Parasite-Host Cell Regulation. Trends in Parasitology. 32 (7), 515-521 (2016).
- Casali, P., Schettino, E. W. Structure and function of natural antibodies. Current Topics in Microbiology and Immunology. 210, 167-179 (1996).
- Ansorg, A., Bornkessel, K., Witte, O. W., Urbach, A. Immunohisto-chemistry and multiple labeling with antibodies from the same host species to study adult hippocampal neurogenesis. Journal of Visualized Experiments. (98), e52551 (2015).
- Tóth, Z. E., Mezey, E. Simultaneous visualization of multi-ple antigens with tyramide signal amplification using antibodies from the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 55 (6), 545 (2007).
- Ma, B., Winkelbach, S., Lindenmaier, W., Dittmar, K. E. Six-colour fluorescent imaging of lymphoid tissue based on colour addition theory. Acta Histochemica. 108 (4), 243 (2006).
- Buchwalow, I. B., Minin, E. A., Boecker, W. A multicolor fluorescence immunostaining technique for simultaneous antigen targeting. Acta Histochemica. 107 (2), 143 (2005).
- Nakamura, A., Uchihara, T. Dual enhancement of triple immunofluorescence using two antibodies from the same species. Journal of Neuroscience Methods. 135 (1-2), 67 (2004).
- McCormick, J., Lim, I., Nichols, R. Neuropeptide precursor pro-cessing detected by triple immunolabeling. Cell and Tissue Research. 297 (2), 197 (1999).
- Shindler, K. S., Roth, K. A. Double immunofluorescent staining using two unconjugated primary antisera raised in the same species. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44 (11), 1331 (1996).
- Wang, B. L., Larsson, L. I. Simultaneous demonstration of multiple anti-gens by indirect immunofluorescence or immunogold staining. Novel light and electron microscopical double and triple staining method employing primary antibodies from the same species. Histochemistry. 83 (1), 47 (1985).
- Lewis Carl, S. A., Gillete-Ferguson, I., Ferguson, D. G. An indirect immunofluorescence procedure for staining the same cryosection with two mouse monoclonal primary antibodies. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 41 (8), 1273-1278 (1993).
- Pranchevicius, M. C., et al. Myosin Va phosphorylated on Ser1650 is found in nuclear speckles and redistributes to nucleoli upon inhibition of transcription. Cell Motility and the Cytoskeleton. 65 (6), 441-456 (2008).
- Moreira, B. P., de Castro, C. G., Prado, L. C. d. S., da Fonseca, C. K., Baqui, M. M. A., Méndez-Vilas, A. Use of antibodies from the same host species in double labeling immunofluorescence on trypanosome cytoskeleton. Microscopy and Imaging Science: Practical Approaches to Applied Research and Education. 7, 374-378 (2016).
- Hull, R. N., Cherry, W. R., Tritch, O. J. Growth characteristics of monkey kidney cell strains LLC-MK1, LLC-MK2, and LLC-MK2 (NCTC-3196) and their utility in virus research. Journal of Experimental Medicine. 115, 903-918 (1962).
- Stecconi-Silva, R. B., Andreoli, W. K., Mortara, R. A. Parameters affecting cellular invasion and escape from the parasitophorous vacuole by different infective forms of Trypanosoma cruzi. Memórias do Instituto Oswaldo Cruz. 98 (7), 953-958 (2003).
- de Souza, W., de Carvalho, T. M., Barrias, E. S. Review on Trypanosoma cruzi: Host Cell Interaction. International Journal of Cell Biology. 2010, 295394 (2010).
- Burleigh, B. A., Woolsey, A. M. Cell signalling and Trypanosoma cruzi invasion. Cellular Microbiology. 4 (11), 701-711 (2002).
- Baqui, M. M. A., Takata, C. S., Milder, R. V., Pudles, J. A giant protein associated with the anterior pole of a trypanosomatid cell body skeleton. European Journal of Cell Biology. 70, 243-249 (1996).
- Baqui, M. M., Milder, R., Mortara, R. A., Pudles, J. In vivo and in vitro phosphorylation and subcellular localization of trypanosomatid cytoskeletal giant proteins. Cell Motility and the Cytoskeleton. 47 (1), 25-37 (2000).
- Baqui, M. M., De Moraes, N., Milder, R. V., Pudles, J. A giant phosphoprotein localized at the spongiome region of Crithidia luciliae thermophila. Journal of Eukaryotic Microbiology. 47 (6), 532-537 (2000).
- Jean-Philippe, J., Paz, S., Caputi, M. hnRNP A1: the Swiss army knife of gene expression. International Journal of Molecular Sciences. 14 (9), 18999-19024 (2013).
- Vidarsson, G., Dekkers, G., Rispens, T. IgG subclasses and allotypes: from structure to effector functions. Frontiers in Immunology. 5, 520 (2014).
