Imunofluorescência de rotulagem dupla usando anticorpos da mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno
Summary
Aqui, o protocolo descreve como realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência usando anticorpos primários criados na mesma espécie para estudar interações hospedeiro-patógeno. Além disso, ele pode incluir o terceiro anticorpo de um host diferente neste protocolo. Esta abordagem pode ser feita em qualquer tipo de célula e patógenos.
Abstract
Hoje em dia, é possível encontrar uma ampla gama de ferramentas moleculares disponíveis para estudar interações células parasitas-hospedeiras. No entanto, existem algumas limitações para a obtenção de anticorpos monoclonais ou policlonais comerciais que reconheçam estruturas celulares específicas e proteínas em parasitas. Além disso, há poucos anticorpos comerciais disponíveis para rotular trypanosomatids. Normalmente, anticorpos policlonais contra parasitas são preparados internamente e poderiam ser mais desafiadores de usar em combinação com outros anticorpos produzidos na mesma espécie. Aqui, o protocolo demonstra como usar anticorpos policlonais e monoclonais criados na mesma espécie para realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência para estudar interações entre células hospedeiras e patógenos. Para alcançar a imunofluorescência de rotulagem dupla, é crucial incubar primeiro o anticorpo policlonal do camundongo e, em seguida, seguir a incubação com o anticorpo secundário IgG conjugado a qualquer fluorocromo. Depois disso, uma etapa de bloqueio adicional é necessária para evitar que qualquer vestígio do anticorpo primário seja reconhecido pelo próximo anticorpo secundário. Em seguida, um anticorpo monoclonal do rato e seu anticorpo secundário subclasse IgG específico conjugado a um fluorocromo diferente são adicionados à amostra nos momentos apropriados. Além disso, é possível realizar imunofluorescência de rotulagem tripla usando um terceiro anticorpo criado em uma espécie diferente. Além disso, estruturas como núcleos e actina podem ser manchadas posteriormente com seus compostos ou rótulos específicos. Assim, essas abordagens aqui apresentadas podem ser ajustadas para qualquer célula cujas fontes de anticorpos primários sejam limitadas.
Introduction
Estudar a interação do patógeno com a célula hospedeira no nível celular fornece informações essenciais sobre as causas subjacentes da doença, uma vez que diferentes grupos, como vírus, bactérias e protozoários, podem infectar a maioria dos tipos de células hospedeiras1,2,3,4. Também pode ajudar a desenvolver e identificar potenciais alvos terapêuticos que podem retardar ou inibir o crescimento do patógeno. Em condições vivas, os anticorpos produzidos são responsáveis pelo reconhecimento de autocomponmentos, antígenos de vírus, componentes ou produtos bacterianos, fungos, parasitas e outros5.
Para isso, os anticorpos são ferramentas amplamente utilizadas, principalmente para a compreensão da localização e função das estruturas celulares e proteínas. Vários estudos utilizando rotulagem múltipla de anticorpos demonstram que etapas adicionais de bloqueio contribuem para a especificidade da imunolocalização. Além disso, a maioria dos protocolos descritos utiliza anticorpos monoclonais comerciais específicos, incluindo anticorpos das mesmas espécies hospedeiras6, 7,8,9,10,11,12,13,14.
Normalmente, a dupla rotulagem imunofluorescência usa dois anticorpos criados em diferentes espécies para manchar as estruturas celulares de interesse ou os patógenos e as células hospedeiras para ver a interação entre eles. No entanto, isso pode ser um problema quando não há anticorpos monoclonais ou policlonais comerciais específicos para alguns patógenos disponíveis para realizar a rotulagem dupla. Além disso, existem kits de conjugação de anticorpos disponíveis comercialmente, e é possível conjugar os anticorpos primários diretamente ao fluoróforo por uma reação de éster succinimidyl15. O problema é que esses kits são muitas vezes caros, e é necessário ter anticorpos suficientes para rotulá-los. Sabendo disso, desenvolvemos com sucesso um método de dupla imunofluorescência usando dois anticorpos diferentes criados na mesma espécie para estudar a localização de proteínas em Trypanosoma brucei16. No entanto, para parasitas intracelulares, incluindo Trypanosoma cruzi, essa abordagem não foi demonstrada. Aqui, mostramos como realizar a dupla rotulagem de imunofluorescência para estudar parasitas intracelulares T. cruzi e a célula hospedeira usando anticorpos primários criados na mesma espécie sem reações cruzadas. Além desse método, foi estabelecida uma rotulagem tripla de imunofluorescência com a adição do terceiro anticorpo de uma espécie diferente. Essas abordagens ajudam quando a fonte de anticorpos é limitada e pode ser usada em qualquer tipo de célula.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, apresentamos um protocolo para realizar imunolabécimo duplo em células infectadas trypanosoma cruzi usando dois anticorpos diferentes da mesma espécie hospedeira. Para estudar, com mais detalhes, as implicações da infecção, estruturas na célula hospedeira, como o núcleo ou organelas citosóicas podem ser rotuladas usando este protocolo. Além disso, pode ser usado no método de rotulagem de imunogold de seção fina pós-incorporação. Essa abordagem ajuda a superar o obstáculo de ter poucos ant…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP 2010/19547-1; 2018/03677-5) ao MMAB, pela Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência- FAEPA ao MMAB e pela Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Brasil (CAPES) – código financeiro 001. A CG-C recebeu bolsa de mestrado e doutorado da CAPES e a LAMT-S recebeu bolsa de doutorado do CNPq. Agradecemos a Elizabete R. Milani pela assistência de microscopia confocal e pelo Dr. Dario Zamboni pelo fornecimento de células LLC-MK2 (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, USP).
Materials
| Alexa Fluor 488 – IgG2b antibody | Life technologies, USA | A21141 | Goat anti-mouse |
| AffiniPure Rabbit anti-mouse IgG (H+L) | Jackson Immunoresearch, USA | 315-005-003 | Anti-mouse antibody |
| Alexa Fluor 488 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A11017 | Goat anti mouse |
| Alexa Fluor 594 IgG1 antibody | Life technologies, USA | A21125 | Goat anti-mouse |
| Alexa Fluor 647 – IgG F (ab')2 (H+L) antibody | Life technologies, USA | A21237 | Goat anti-mouse |
| Anti-hnRNPA1 antibody IgG2b | Sigma-Aldrich, USA | R4528 | Mouse antibody |
| anti-TcFAZ (T. cruzi FAZ protein) antibody | Our lab | In-house | Mouse antibody |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich, USA | A2153-10G | Albumin protein |
| Detergent Igepal CA-630 | Sigma-Aldrich, USA | I3021 | Nonionic Detergent |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 12657-029 | Serum |
| Penicillin Streptomycin | Gibco, Thermo fisher scientific, USA | 15140-122 | Antibiotic |
| Phalloidin Alexa Fluor 594 | Life technologies, USA | A12381 | Actin marker |
| ProLong Gold antifade with DAPI | Life technologies, USA | P36935 | Mounting media reagent |
| RPMI 1640 1X with L-glutamine | Corning, USA | 10-040-CV | Cell culture media |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma-Aldrich, USA | T4049-100ML | Bioreagent |
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