Keratinosit Kök Hücre Plastisitesini Modellemek için Yüksek Verimli Epidermal Sferoid Kültür Sistemi Kurulması
Summary
Burada 3D süspansiyon kültüründe epidermal sferoidlerin sistematik olarak yetiştirilmesi için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, çeşitli epitel doku tiplerinde kullanılmak ve çeşitli insan hastalıklarının ve koşullarının modellenimi için geniş kapsamlı uygulamalara sahiptir.
Abstract
Epitel düzensizliği, kronik yaralama, iltihaplanma ve tüm insan kanserlerinin% 80’inden fazlası dahil olmak üzere çeşitli insan koşulları ve rahatsızlıkları için bir düğümdür. Bir astar dokusu olarak, cilt epitel genellikle yaralanmaya maruz kalır ve hasarlı dokuyu onarmak için gerekli hücresel plastisiteyi elde ederek evrimsel olarak adapte olur. Yıllar boyunca, in vitro ve ex vivo hücre bazlı modeller kullanarak epitel plastisitesini incelemek için çeşitli çabalar sarf edilmiştir. Bununla birlikte, bu çabalar epitel hücre plastisitesinin çeşitli aşamalarını yeniden yakalama kapasitelerinde sınırlı olmuştur. Burada primer yenidoğan insan keratinositlerinden 3D epidermal sferoidler ve epidermal sferoid türevli hücreler üretmek için bir protokol açıklıyoruz. Bu protokol, epidermal sferoid kültürlerinin keratinosit üretici plastisitenin farklı aşamalarını işlevsel olarak modelleme kapasitesini özetlemektedir ve epidermal küresel re-kaplamanın integrinα6hi/EGFRlo keratinosit subpopulasyonları için heterojen normal insan keratinosit (NHKc) kültürlerini gelişmiş kök benzeri özelliklerle zenginleştirebileceğini göstermektedir. Raporumuzda cilt keratinosit plastisitesi ve epidermal rejenerasyon çalışması için yüksek verimli bir sistemin geliştirilmesi ve sürdürülmesi açıklanmaktadır.
Introduction
Memeli tabakalı epitel, tüm canlı sistemlerde en karmaşık epitel mimarisidir ve en sık hasar ve yaralanmaya maruz kalır. Koruyucu bir doku olarak, tabakalı epitel karmaşık ve etkili bir doku hasarı tepkisi oluşturmak için evrimleşmiştir. Yaralanma üzerine, bu hücreler, yaralı bölgeye göç etmelerini ve onarım1,2,3‘ü gerçekleştirmelerini sağlayan soy plastisite programlarını etkinleştirmelidir. Bu çok yönlü yanıt, yedenmiş olarak anlaşılan birkaç sıralı adımda gerçekleşir.
Epitel rejenerasyonunun karmaşık sürecinin incelenmesinde büyük bir engel, hücre yenilenmesinin tanımlanmış aşamalarında dinamik hücresel aktiviteleri yakalayabilen yüksek verimli model sistemlerinin değerinde yatmaktadır. In vivo fare modelleri yara iyileşmesi hakkında ilgili içgörüler sunarken ve insan rejeneratif sürecini en yakından özetlese de, gelişimleri zahmetli çabalar ve önemli maliyet gerektirir ve üretim kapasitelerini sınırlar. Bu nedenle, insan epitel dokusu yenilenmesinin yüksek verim ölçeğinde fonksiyonel olarak araştırılmasını sağlayan sistemlerin kurulması için kritik bir ihtiyaç vardır.
Son yıllarda ölçeklenebilirlik zorluğunun karşılanması için çeşitli girişimlerde bulunulmuştur. Bu, in vivo rejeneratif bağlamı yakından taklit eden yenilikçi in vitro ve ex vivo hücre tabanlı modellerin büyük genişlemesi ile görülür. Bu, çip üzerindekiorgan-on-chip 4, küresel5, organoid6ve organotipik kültürlerdeki gelişmeleri içerir7. Bu 3D hücre tabanlı sistemlerin her biri benzersiz avantajlar sunar ve farklı deneysel sınırlamalar sunar. Bugüne kadar, küresel kültür en uygun maliyetli ve yaygın olarak kullanılan 3D hücre kültürü modeli olmaya devam etmektedir. Ve birkaç rapor sferoid kültürlerinin cilt kök hücre özelliklerini incelemek için kullanılabileceğini belirtmiş olsa da, bu çalışmalar büyük ölçüde hayvan dokusu8,9veya dermal fibroblastlar10, insan epidermal küresel kültürlerinin rejeneratif özelliklerini iyice karakterize eden neredeyse hiçbir rapor olmadan yapılmıştır. Bu protokolde epidermal sferoid kültürlerin normal insan keratinositlerinden (NHKc) fonksiyonel gelişimini, kültürünü ve bakımını detaylandırıyoruz. Epidermal rejenerasyon ve keratinosit kök hücre plastisitesinin sıralı evrelerini in vitro olarak modellemek için bu sistemin yararlarını eşit olarak açıklıyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
3D küresel kültür sistemlerinin kullanımı hücre saplığını değerlendirmede geniş bir faydaya sahiptir. Bu sistemlerin doku kök hücrelerinin zenginleştirilmesini artırdığı gösterilmiştir13, ancak insan epidermal kök hücrelerinin incelenmesi için yararları sınırlı olarak araştırılmıştır. Burada, 3D kültür tekniklerini kullanarak insan keratinosit kök hücrelerini zenginleştirmek için bir strateji açıklıyoruz. Bu sistemde, NHKc, KSFM-scm içeren agarose yatakl…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
UofSC Tıp Fakültesi Enstrümantasyon Kaynak Tesisi (IRF), görüntüleme ve hücre sıralama ekipmanlarına ve teknik yardıma erişim sağladı. Bu çalışma kısmen 1R21CA201853 hibesi ile desteklendi. MCF ve IRF, NIH hibe P20GM103499, SC INBRE’den kısmi destek alır. MCF ayrıca NIH hibe P20GM109091’den de destek alır. Yvon Woappi kısmen NIH tarafından 2R25GM066526-06A1 (PREP) ve R25GM076277 (IMSD) hibeleri ve UofSC’deki Grace Jordan McFadden Profesörler Programı tarafından burs ile desteklenmiştir. Geraldine Ezeka ve Justin Vercellino, UofSC’de NIH hibeleri 2R25GM066526-10A1 (PREP) tarafından desteklendi. Sean M. Bloos, UofSC’de 2016 Magellan Akademik Ödülü ile desteklendi.
Materials
| Affymetrix platform | Affymetrix | For microarray experiments | |
| Affymetrix’s HuGene-2_0-st library file | Affymetrix | Process | |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent | For microarray experiments | |
| All Prep DNA/RNA Mini Kit | Qiagen | 80204 | Used for RNA isolation |
| Analysis Console Software version 3.0.0.466 | analyze cell type specific transcriptional responses using one-way between-subject analysis of variance | ||
| BD FACSAria II flow cytometer | Beckman | For flow cytometry | |
| Console Software version 3.0.0.466/Expression console Software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| Cytokeratin 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | 1:200 dilution |
| Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | For cell media |
| FITC-conjugated anti-integrinα6 | Abcam | ab30496 | For FACS analysis |
| GeneChip Command Console 4.0 software | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For confirming data quality | |
| GeneChip Fluidics Stations 450 (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific) | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip HuGene 2.0 ST Arrays | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | |
| GeneChip Hybridization Oven 640 | Thermo Fisher Scientific | For hybridization and amplifycation of total RNA | Amplify labeled samples | |
| GeneChip Hybridization Wash, and Stain Kit (Affymetrix/Thermo Fisher Scientific). | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For washing and staining of hybridized arrays | |
| GeneChip Scanner 3000 7G system | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | Scanning hybridized arrays | |
| GeneChip WT PLUS Reagent Kit | Affymetrix/Thermo Fisher Scientific | For amplifycation of biotinylating total RNA | |
| Human Basic Fibroblast Growth Factor (hFGF basic/FGF2) | Cell Signaling Technology | 8910 | For cell media |
| Human Epidermal Growth Factor (hEGF) | Cell Signaling Technology | 8916 | For cell media |
| Human Insulin | Millipore Sigma | 9011-M | For cell media |
| iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) | Bio-Rad | 1708880 | Used for RT-qPCR |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad | 1708890 | Used for RT-qPCR |
| KSFM | ThermoFisher Scientific | 17005041 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| KSFM-scm | ThermoFisher Scientific | 17005042 | Supplemented with 1% Penicillin/Streptomycin, 20 ng/ml EGF, 10 ng/ml basic fibroblast growth factor, 0.4% bovine serum albumin (BSA), and 4 µg/ml insulin |
| MCDB 153-LB basal medium | Sigma-Aldrich | M7403 | MCDB 153-LB basal media w/ HEPES buffer |
| NEST Scientific 1-Well Cell Culture Chamber Slide, BLACK Walls on Glass Slide, 6/PK, 12/CS | Stellar Scientific | NST230111 | For immunostaining |
| P63 | Thermo Scientific | 703809 | 1:200 dilution |
| PE-conjugated anti-EGFR ( San Jose, CA; catalog number ) | BD Pharmingen | 555997 | For FACS analysis |
| pMSCV-IRES-EGFP plasmid vector | Addgene | 20672 | For transfection |
| Promega TransFast kit | Promega | E2431 | For transfection |
| Qiagen RNeasy Plus Micro Kit | Qiagen | For microarray experiments | |
| Thermo Scientific™ Sterile Single Use Vacuum Filter Units | Thermo Scientific | 09-740-63D | For cell media |
| Zeiss Axionvert 135 fluorescence microscope | Zeiss | Use with Axiovision Rel. 4.5 software |
References
- Patel, G. K., Wilson, C. H., Harding, K. G., Finlay, A. Y., Bowden, P. E. Numerous keratinocyte subtypes involved in wound re-epithelialization. Journal of Investigative Dermatology. 126 (2), 497-502 (2006).
- Dekoninck, S., Blanpain, C. Stem cell dynamics, migration and plasticity during wound healing. Nature Cell Biology. 21 (1), 18-24 (2019).
- Byrd, K. M., et al. Heterogeneity within Stratified Epithelial Stem Cell Populations Maintains the Oral Mucosa in Response to Physiological Stress. Cell Stem Cell. , (2019).
- Rothbauer, M., Rosser, J. M., Zirath, H., Ertl, P. Tomorrow today: organ-on-a-chip advances towards clinically relevant pharmaceutical and medical in vitro models. Current Opinion in Biotechnology. 55, 81-86 (2019).
- Kim, S. J., Kim, E. M., Yamamoto, M., Park, H., Shin, H. Engineering Multi-Cellular Spheroids for Tissue Engineering and Regenerative Medicine. Advanced Healthcare Materials. , 2000608 (2020).
- Lee, J., et al. Hair-bearing human skin generated entirely from pluripotent stem cells. Nature. 582 (7812), 399-404 (2020).
- Zhang, Q., et al. Early-stage bilayer tissue-engineered skin substitute formed by adult skin progenitor cells produces an improved skin structure in vivo. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 407 (2020).
- Borena, B. M., et al. Sphere-forming capacity as an enrichment strategy for epithelial-like stem cells from equine skin. Cellular Physiology and Biochemistry. 34 (4), 1291-1303 (2014).
- Vollmers, A., et al. Two- and three-dimensional culture of keratinocyte stem and precursor cells derived from primary murine epidermal cultures. Stem Cell Reviews and Reports. 8 (2), 402-413 (2012).
- Kang, B. M., Kwack, M. H., Kim, M. K., Kim, J. C., Sung, Y. K. Sphere formation increases the ability of cultured human dermal papilla cells to induce hair follicles from mouse epidermal cells in a reconstitution assay. Journal of Investigative Dermatology. 132 (1), 237-239 (2012).
- Woappi, Y., Hosseinipour, M., Creek, K. E., Pirisi, L. Stem Cell Properties of Normal Human Keratinocytes Determine Transformation Responses to Human Papillomavirus 16 DNA. Journal of Virology. 92 (11), (2018).
- Woappi, Y., Altomare, D., Creek, K., Pirisi, L. Self-assembling 3D spheroid cultures of human neonatal keratinocytes have enhanced regenerative properties. Stem Cell Research. , (2020).
- Toma, J. G., McKenzie, I. A., Bagli, D., Miller, F. D. Isolation and characterization of multipotent skin-derived precursors from human skin. Stem Cells. 23 (6), 727-737 (2005).
- Li, F., et al. Loss of the Epigenetic Mark 5-hmC in Psoriasis: Implications for Epidermal Stem Cell Dysregulation. Journal of Investigative Dermatology. , (2020).
- Kuo, C. T., et al. Three-dimensional spheroid culture targeting versatile tissue bioassays using a PDMS-based hanging drop array. Scientific Reports. , (2017).
- Woappi, Y., Ezeka, G., Vercellino, J., Bloos, S. M., Creek, K. E., Pirisi, L. GSE94244 – Expression data from normal human spheroid-forming keratinocytes in monolayer mass culture and from corresponding cornified-like spheroid ring structures. Gene Expression Omnibus (GEO). , (2020).
